牛奶中磺胺类化合物检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RKFT-004 解决方案 牛奶中磺胺类化合物的检测 全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺类化合物 介绍 磺胺类药物(Sulfonamides， SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物，养殖业中常将磺胺类药物作为防治动物细菌性疾病而广泛使用。但是磺胺会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物源性食品中残留引起人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如其存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎和肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。 本方案参考 《GB/T 22966-2008牛奶和奶粉中16种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，采用高氯酸溶液对目标化合物进行提取， HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。整个方法具有良好的平行性与准确性，可用于对牛奶样品中磺胺类药物的检测。 1.仪器与耗材 仪器和耗材 睿科Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260， 质谱检测器(I(MS) Agilent 6410 HLB固相萃取柱 (RayCure，60mg/3mL，货号：RC-204-36473) 甲醇(色谱纯)，超纯水 0.5%高氯酸溶液(pH=2.0)：1000mL 水中加入5mL高氯酸，再调节 pH=2 甲醇-乙酸溶液(1+19)：量取5mL 甲醇与95mL 0.1%乙酸溶液混合 2.样品制备及前处理 2.1提取 称取2g牛奶样品于50mL 离心管中，加入20mL 高氯酸溶液，涡旋震荡提取 lmin，超声萃取10min，待净化。 2.2固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus 固相萃取柱 HLB柱(RayCure，60mg/3mL) 活化 甲醇，高氯酸溶液 淋洗 超纯水 洗脱 甲醇 分别以3mL 甲醇和5mL 高氯酸溶液活化 HLB柱，将上述提取液以 2mL/min 的速度进行上样，并用5mL高氯酸溶液清洗样品瓶。用 5mL 超纯水对固相萃取柱进行淋洗除去残留的酸和其他杂质，用气推的方式将柱子推干。最后以3mL甲醇洗脱目标化合物(具体方法设置见图2)。将洗脱液用 EVA 80 全自动平行浓缩仪在40℃条件下浓缩至约0.2mL， 加入甲醇-乙酸溶液定容至1mL，涡旋昆匀，过滤膜上机分析。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间(min) 1 清洗样品通道 甲醇 1..5 2 活化 甲醇 有机废液 2 3 1.9 3 活化 0.5%高氯酸 废水 2 5 2.9 4 上样 废水 2 22 12.4 5 清洗样品瓶 0.5%高氯酸 废水 60 5 3.4 6 淋洗 水 废水 2 5 2.9 7 气推 废水 80 40 2.8 8 清洗注射泵 甲醇 60 3 0.4 9 洗脱 甲醇 收集 1 3 3.4 10 气推 收集 1 2 2.4 11 气推 收集 20 10 1..3 12 结束 图-1. Fotector Plus 固相萃取净化方法 3.检测条件 3.1色谱柱条件 表-2色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×21 mmx50mm 流速 0.200mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetic(0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 35°C 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI+ 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-1.5 min， 93%流动相A； 1.51-3.0 min， 60%的流动相 A；3.01-5.5 min 10%流动相A，保持2min； 5.51-6.0 min，93%的流动相 A，6.01-10.0 min， 93%的流动相A。 3.2 MRM 参数 表-3.16种磺胺类抗生素串联质谱检测参数 Compound Name PrecursorIon Productlon Dwell Fragmentor CollisionEnergy Cell AcceleratorVoltage 磺胺醋酰 215 155.9 15 63 9 4 108 15 63 17 4 磺胺嘧啶 251 185.1 15 103 13 4 156 15 103 9 4 磺胺噻唑 256 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺吡啶 250 184.1 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲基嘧啶 265 172 15 102 13 4 156 15 102 13 4 甲氧苄氨嘧啶 291 261.1 15 142 21 4 230.1 15 142 21 4 磺胺二甲嘧啶 279 186 15 107 13 4 155.9 15 107 13 4 磺胺甲噻噁唑 271 156 15 88 9 4 108 15 88 21 4 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 126 15 112 21 4 磺胺6-甲氧嘧啶 281 215.1 15 117 13 4 156 15 117 13 4 磺胺甲氧哒嗪 281 156 15 107 13 4 108 15 107 25 4 磺胺氯哒嗪 285 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺邻二甲氧嘧啶 311 156 15 117 13 4 108 15 117 25 4 磺胺甲基异噁唑 254 156 15 103 13 4 147.1 15 103 9 4 磺胺二甲异噁唑 268 156 15 105 12 4 113.1 15 105 20 4 磺胺喹噁啉 301 156 15 105 15 4 208 15 105 9 4 3.3色谱图 以下为16种磺胺类化合物标准品的质谱图： +ESI MRM Frag 63. 0V CF 0.000 DF0.000CID69.0 (215.0000->155.9000)C06.d 磺胺醋酰 11.2 2.221.受nf424.44 254 4.样品测试 4.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，本实验需用空白基质提取液来配制标准工作曲线。 4.2 样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向牛奶样品(2g)中加入16种磺胺类标准品(20uL， 1mg/L，n=3)进行加标回收验证，测试结果如表-4所示。所有化合物的回收率在79%-96%之间， RSD 值均小于8%，说明该方法能够很好地用于牛奶样品中16种磺胺类抗生素的检测。取奶粉 1g，添加标准品(100uL， 1ppm)进行 ( 上述样品前处理过程，实验结果如下表-2所示。回收率在87%-97%之间， RSD=4.76%(n=4)，符合回收率以 热线：400-885-1816 网址： ： w ww.raykol.com 邮箱： i n fo@raykol.com ) 及相对标准偏差的要求。 表-4.18种磺胺的加标回收率及 RSD 值(20ng/L) 化合物 (Compound) 回收率(%) 样品-1 Sample-1 回收率(%)样品-2 Sample-2 回收率(%) 样品-3 Sample-3 平均回收率 Average Recovery(%) RSD(%) 磺胺醋酰 80.4 75.0 82.4 79.3 4.8 磺胺嘧啶 77.7 85.8 81.1 81.5 5.0 磺胺噻唑 95.6 87.3 82.0 88.3 7.8 磺胺吡啶 99.4 89.1 86.3 91.6 7.5 磺胺甲基嘧啶 92.9 84.5 84.8 87.4 5.5 甲氧苄胺嘧啶 97.3 89.2 87.2 91.3 5.8 磺胺二甲嘧啶 94.0 87.8 84.9 88.9 5.3 磺胺甲噻噁唑 92.8 84.8 83.4 87.0 5.8 磺胺对甲氧嘧啶 93.3 88.8 87.6 89.9 3.3 磺胺6-甲氧嘧啶 91.6 87.3 82.3 87.1 5.4 磺胺甲氧哒嗪 92.1 85.4 80.7 86.1 6.6 磺胺氯哒嗪 87.9 83.5 81.0 84.1 4.2 磺胺邻二甲氧嘧啶 102.9 96.9 87.9 95.9 7.9 磺胺甲基异噁唑 91.2 89.3 85.7 88.8 3.2 磺胺二甲异噁 88.7 88.6 84.5 87.3 2.7 磺胺喹噁啉 91.0 86.7 82.6 86.8 4.9 5.结果与讨论 牛奶中蛋白质含量比较高，本方法将高氯酸的浓度比例提高提0.5%，可以更加有效的沉降蛋白，同时可减少提取液用量，节省过柱时间。 样品提取后若溶液比较浑浊，可以用高速离心机离心后再上全自动固相萃取仪过柱，防止堵塞12通阀或 SPE小柱。 6.总结 睿科Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时 Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪通过独特的针自动追随液面技术，可以极大地减少氮气使用量，同时避免手动氮吹需要经常去调节氮吹针高度带来的麻烦。 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.，Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2021年10月版 热线：箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：： Vwww.raykol.com 磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物，养殖业中常将磺胺类药物作为防治动物细菌性疾病而广泛使用。但是磺胺会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物源性食品中残留引起人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如其存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎和肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。本方案参考《GB/T 22966-2008 牛奶和奶粉中16种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》，采用高氯酸溶液对目标化合物进行提取，HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。整个方法具有良好的平行性与准确性，可用于对牛奶样品中磺胺类药物的检测。关键词：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺类化合物