血浆中类二十烷酸检测方案(液质联用仪)

ApplicationNewshttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2021年3月400-650-0439 ApplicationNews 超高效液相色谱质谱联用仪 LCMSTM-8060 使用血浆微量采样样品建立快速类二十烷酸质谱分析法 01-00124-CN 山田真希、长野直子、久保晴美、服部考成 使用益处 可以在10分钟内监测人体血浆中包含类二十烷酸的脂肪酸代谢产物。 NexeraTM和超高速三重四极杆质谱仪LCMS-8060 可进行高通量分析。 可以使用微采样设备 MSW2TM准确地进行样品的微量采集。 前言 类二十烷酸和 omega-3脂肪酸代谢产物是阐明病理生理功能以及探索疾病生物标志物的重要目标物。在2019年 ASMS的报道中，作者开发出了能够监测类二十烷酸类组分的MRM (多反应监测)方法，并报告对患病模型小鼠血清中检测到的100多种组分的定量谱分析"。 在本报告中，也会介绍使用微量血浆快速构建类二十烷酸分析系统。为提高检测速度和灵敏度，将 MRMs 的数量缩小到检测目标物及内标物所需最小值，即可在10分钟内监测类二十烷酸及相关脂肪酸代谢产物等共114种组分。也会报告使用新开发的方法分析使用微采样设备 MSW2 微量采集的市售人血浆(5.6uL)并检测类二十烷酸的示例。 分析条件 标准样品购自Cayman Chemical (Ann Arbor， MI)。人血浆和人血清购自 Kohjin-bio 株式会社。使用微采样设备 MSW2(由本公司制造)采集一定量的血浆。固相萃取试剂盒使用 STRATATM-X10mg (Phenomenex Torrance， CA)。 测定设备使用 LC-40系列Nexera UHPLC系统和超高速三重四极杆质谱仪 LCMS-8060(图2)。HPLC 以及质谱仪的分析条件如表1所示。 |微采样设备MSW2 MSW²是一种独特的微采样设备，用于从全血中微量采集血浆。 在使用树脂制成的 Microsampling WingTM (图1)中采集全血， 直接进行离心分离，以在微流路中分离为血浆和血细胞。离心后，只需折下定容部分，即可准确采集一定量的血浆。此外，由于Microsampling Wing 是树脂材质，耐溶剂性高，因此，可用于在管中进行脱蛋白等预处理。 图1微采样设备 MSW2TM 的 Microsampling WingTM [HPLC 的条件](Nexera X3) 色谱柱 Shim-packTM GIST C18-AQ HP (100 mm ×2.1 mm l.D.， 1.9 um) 柱温箱 40°C 流动相A 0.1%甲酸水溶液 流动相B 乙腈 流速 0.4 mL/min 进样量 5 uL (与15 pL水共同进样) [MS的条件](LCMS-8060) 离子源 ESI， 正/负 扫描模式 MRM 雾化气流量 2.5 L/min 干燥气流量 10.0 L/min 加热气流量 10.0 L/min DL温度 250°C 加热模块温度 400°C 接口温度 270°C CID 气体压力 230 kPa 延迟时间/暂停时间 10 msec/1 msec *1 P/N 227-30807-02 UF MRM (Max.555/sec) 图 2 LCMSTM-8060 的外观 预处理 图3所示为从人血浆中萃取脂肪酸的过程。向微采样设备MSW2 采集的血浆 5.6 uL中加入含有0.1%甲酸的甲醇300uL和18种组分的内标物质溶液10uL，然后搅拌5分钟。离心后，用0.1%甲酸水稀释上清液，装入固相萃取试剂盒中进行萃取。将萃取液干燥后，用30 uL甲醇溶解，制备LCMS分析样品。 |结果 <快速分析方法开发> 之前 (Ref.1)报道了一种MRM 方法，可在20分钟内分析196个类二十烷酸类目标物物18个内标(ISTD)物质。使用该方法从疾病模型小鼠血清中共检测到109种组分，并进行了定量分析。18种内标组分的 MRM色谱图(20分钟法)如图4的上半部分(I)所示。 为了加快分析速度，将目标物组分数量缩小到114种，也就是上述109种组分再加上5种。在10分钟的分析时间内共设定了200组MRM 离子对，包括18种内标组分。在新开发的方法中，18种内标组分的 MRM 色谱图如图4的下半部分(II)所示。在新开发的10分钟方法中，前列腺素E-d4 (PGE-d4)和PGDz-d4分在在5.05分钟和5.24分钟时洗脱，分离度为3.0。20分钟法两种组分的分离度为3.8，在不影响分离的情况下缩短了分析时间。 Ⅱ.新10分钟方法 图4内标物质(18种组分)的 MRM 色谱图1.20分钟方法 (ASMS2019) Ⅱ.新10分钟方法 <人血浆分析> 在 5.6 uL的人血浆中检测到包括主要的花生四烯酸代谢产物在内的50种组分，例如 5-、8-、11-、12-及 15-HETEs。表2所示为以良好重现性检测到的36种组分的峰高比(目标物/对应的内标物质)和重现性 (CV%，n=3)。 表2人血浆(5.6uL)中检测到的组分高度比 缩略语 结论 开发出的高通量分析方法可在10分钟内监测包括类二十烷酸在内的脂肪酸代谢产物的114种组分。试验证明，使用本方法可以从5.6 uL人血浆(相当于MSW2 微量采样的量)中定量检测到包括类二十烷酸在内的36种组分以上的脂肪酸代谢产物、DHA代谢产物以及亚麻酸代谢产物。 这些结果有望应用于使用再利用 (Re-using) 小鼠的病理生理学研究等。 ( <参考文献> ) Nexera、LCMS、MSW2、Shim-pack 以及 Microsampling Wing 是株式会社岛津制作所在日本及其他国家的商标。Kinetex 以及 STRATA 是 Phenomenex， Inc. 的注册商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明： ) *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 类二十烷酸和omega-3脂肪酸代谢产物是阐明病理生理功能以及探索疾病生物标志物的重要目标物。在2019年ASMS的报道中，作者开发出了能够监测类二十烷酸类组分的MRM（多反应监测）方法，并报告对患病模型小鼠血清中检测到的100多种组分的定量谱分析。本报告中将介绍使用微量血浆快速构建类二十烷酸分析系统。为提高检测速度和灵敏度，将MRMs的数量缩小到检测目标物及内标物所需最小值，即可在10分钟内监测类二十烷酸及相关脂肪酸代谢产物等共114种组分。也会报告使用新开发的方法分析使用微采样设备MSW微量采集的市售人血浆（5.6μL）并检测类二十烷酸的示例。