中药血塞通和血栓通注射剂中人参皂苷检测方案(工作站及软件)

thermoscientific RPLC-CAD 结合 HILIC-UV 在中药血塞通和血栓通注射剂指纹图谱分析中的应用 基于整体表征的中药指纹图谱是国内外广泛接受的一种中药质量评价模式。中药的复杂性决定了单一分离模式无法满足中药化学成分表征的需求，多种分离模式组合将有利于强极性组分、同系物组分和微量组分的表征。本文基于反相色谱(RPLC)结合亲水相互作用色谱(HILIC)，采用外外检测(UV)结合电喷雾检测(CAD)对血塞通和血栓通注射液的化学成分同时进行指纹图谱表征，采用 Vanquish Duo UHPLC 系统，快速高效对血塞通注射液进行了质量评价。 电喷雾检测器，中药注射剂，人参皂苷，亲水相互作用 1.引言 中药注射剂是指将中药材进行提取、纯化后制成的可以注入人体内的溶液、乳状液，或是溶液粉末等，具有生物利用度高、疗效确切、作用迅速等特点，在抢救神志昏迷、不能口服的重症患者和急救等方面，一直发挥着独特作用。中药注射剂是中药现代化的重要代表，其科技竞争力上整体优于其他剂型。但近年来，不良反应事 故频发，引发患者对中药注射剂安全性的担忧。2017年10月8日，中共中央办公厅、国务院办公厅印发《关于深化审评审批制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》提出，未来将严格药品注射剂审评审批，同时对已上市药品注射剂进行再评价，力争用5至10年左右时间基本完成。 目前我国已上市中药注射剂134个品种，生产企业216家。近期，国家药品监督管理局表示拟启动注射剂再评价工作，中药注射剂相关问题引起各方关注。 对中药注射剂总固形物所含成分进行系统研究，是中药注射剂质量研究的重要组成部分。同时也是保证中药注射剂安全性、有效性和均一性的重要基础。中药指纹图谱是全面反映中药注射剂化学组成的重要手段和基本要求。由于中药所含化学成分复杂，结构类似物众多，单一分离和检测手段难以全面表征其物质组成。因此多息多维指纹图谱是中药注射剂质量评价的必然选择。 血栓通和血塞通注射液是从五加科人参属植物三七[Panax notoginseng ( Burk.) F. H. Chen] 根或根茎中提取的有效部位-三七总皂苷 (Panax Notoginseng Saponins， PNS)精制而成的灭菌水溶液，具有活血化瘀，通脉活络之功效，临床常用于中风偏瘫、动脉粥状硬化性血栓性脑梗塞、脑血栓、脑血管出血后遗症及视网膜中央静脉阻塞等症的治疗，是目前中药注射剂中销售额较大的两个品种。本文采用了 Vanquish Duo系统的并联双针进样模式，分别采用 HILIC 和 RP 两种色谱柱，采用UV结合 CAD检测器，对其成分进行了表征分析。 2.实验部分 2.1仪器与式剂 2.1.1Vanquish Duo UHPLC 超高效液相色谱仪 ChromeleonMChromatography Data System，变色龙色谱软件，版本7.2 SR9 2.1.2 Corona CAD VEO 电雾式检测器， 2.1.3注射用血塞通：批号：16EB207；规格：200mg/支，注射用血栓通，批号为：16080310，规格：150mg/支。 2.1.44 乙腈、甲醇(色谱级， Fisher公司)，去离子水(18.2MQ，Milipore纯水机)，甲酸(LC-MS，Fisher公司)。 2.1.5样品溶液制备：取注射用血塞通和血栓通样品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并制成浓度为 5 mg/mL的样品溶剂，直接进样分析。 2.2色谱条件 2.2.1RPLC-CAD分析 色谱柱：：Thermo acclaim polar advantage C16(100×2.1 mm，2.2 um) 柱温：25℃； 进样量：2pL； 流动相：A相为乙腈，B为0.1%(VN)甲酸，梯度洗脱程序见表2。 CAD参数：采集频率5Hz， Filter， 3.6s， EvaporatorTemp， 50℃， PF=1.0 时间 A B 流速 0.00 16.0 84.0 0.4 0.5 16.0 84.0 0.4 5.0 22.0 78.0 0.4 11.0 27.0 73.0 0.4 12.0 30.0 70.0 0.4 16.0 31.0 69.0 0.4 19.0 35 65.0 0.4 21.0 38.0 62.0 0.4 27.0 49.0 51.0 0.4 32.0 95.0 5.0 0.4 2.2.2 HILIC-UV分析 色谱柱： Accucore Amide HILIC (15 cm*2.1 mm*2.6 um)PN：16726-152130。 流动相：A相为水，B为乙腈，梯度洗脱见表3.。进样量：2uL； 表 2. HILIC-UV分析梯度程序 时间 A B 流速 0.0 5.0 95.0 0.4 1.0 5.0 95.0 0.4 25.0 30.0 70.0 0.4 30.0 30.0 70.0 0.4 40.0 80.0 20.0 0.4 41.0 5.0 95.0 0.4 UV检测：波长203nm 并联系统连接见图 1.。 图1. Vanquish Flex Duo 系统并联模式 3.1分离正交性评价 皂苷类化合物是三七主要活性成分，围绕三七皂苷类成分化学、结构转化、生物转化、药理、质量评价等研究较多。由于三七皂苷中分子量相同的结构类似成分众多，单一分离模式无法全面表征三七的化学物质基础。RPLC 由于分离效能高，仍是分析人参皂苷的主流分离 模式；亲水相互作用色谱 HILIC， 是分离分析极性化合物的重要手段。人参皂苷一般是由亲脂性的苷元基团和亲水性的糖链组成，因此 RP 和 HILIC具有良好的正交选择性。本试验采用15种人参皂苷对照品对两者的正交性进行了评价。 图2.15种人参皂苷混合对照品分别在 RP-CAD分析(A)和 HILIC-UV(B)上分析谱图 图3正交性评价结果 人参皂苷化合物按照苷元类型可分为达玛烷型和齐墩果烷型，其中三七中主要含有达玛烷型人参皂苷。在该类型人参皂苷中，又可按照苷元的结构，分为原人参三醇型(PPT)和原人参二醇型(PPD)型，对比分析人参皂苷化合物在RPLC 和 HILIC 上的保留行为，可以总结出以下结论：：1)在RPLC分离中， 0-16 min 一般以PPT型人参皂苷为主；16 min 之后以 PPD型人参皂苷为主；而在HILIC-UV分析中，各人参皂苷主要按照糖链或糖的数量进行分离，在相同糖链下， PPT 型人参皂苷保留更强；因此二者可基于人参皂苷结构特点对其进 行总体表征；2)对于人参皂苷Rb，及其含4糖及以上的人参皂苷，在HILIC 上可以获得更佳的分离效果；3)人参皂苷Rh，为6-0-葡萄糖-PPT型皂苷， 在 RPLC谱图上为重叠峰且分布在PPD 出峰区域，但该化合物在HILIC上保留相对较弱，且干扰较少，同时在RP上相对较难分离的人参皂苷Rg，和 Re的分离，在 HILIC上分离度更高；反过来对于含有相同糖基数量的 Rb，和Rbs， HILIC 上无法区分，但在RP上分离较好，总体上两种分离模式在分析同一样品时，具有良好的互补效果，从而可以更全面对产品进行质量评价。 图4.血塞通注注剂 RPLC-CAD 指纹普图(上)和 HILIC-UV指纹图谱(下)叠加谱图 血塞通和血栓通均以三七总皂苷提取物为原料药制备而成。在2015版药典一部中药提取物部分中，三七总皂苷提取物可以由三七根或根茎提取制备，以5个主要人参皂苷(三七皂苷R，人参皂苷Rg， Re， Rb， Rd)的含量和总量，结合HPLC-UV 指纹图谱，以相似度进行评价(相似度>0.95)，来综合控制原料药的质量。但由于三七不同药用部位的人参皂苷组成并不相同，并且各生产厂家制备工艺也不尽相同，再加上药材的不同规格、产地、采收期等因素的影响，都给实际原料及其产品的质量控制和评价带来很大的挑战。 本实验针对注射用血塞通和血栓通的化学物质基础，分别从RPLC-CAD 和 HILIC-UV 两个分离模式下进行对比分析，结果在 HILIC-UV 指纹图谱中，血栓通中PPD单糖型的人参皂苷含量明显低于血塞通；人参皂苷Rd，Rb2+Rbs， F(需要MS进一步定性)的含量也明显低于血塞通；在RPLC-CAD指纹图谱中，也可以得出相同结论，除此之外， RT=15.922min 的色谱峰也明显低于血塞通，此化合物需 MS 进一步定性。由此可知，血塞通和血栓通虽然均以三七总皂苷为原料，但在某些微量皂苷组成和含量上差异较大，由此带来的对药效和副作用的影响仍需深入研究。 图5.注射用血塞通与血栓通在 HILIC-UV 下叠加谱图 图6.注射用血塞通与血栓通在 RPLC-CAD 下叠加谱图 本文采用 Vanquish Duo UHPLC系统，，针对中药注射剂血塞通和血栓通，建立了基于反相色谱-电雾式检测(RPLC-CAD)和亲水相互作用色谱-紫外检测(HILIC-UV)的指纹图谱，并同时对样品中化学成分进行了表征分析。采用 Vanquish Duo 的并联模式，在相同时间获得了 RPLC 和 HILIC 两维分离以及 CAD和UV两种检测通道的数据，提高一倍分析效率的同时，获取了更多的化学物质组成信息。结果表明 RPLC 和HILIC 对人参皂苷类化合物分离具有良好的正交性，结合两种不同分离模式，可以更加全面表征从常量到微量、痕量人参皂苷的细微差异，为保证产品质量和一致性奠定基础。 ( 1、 中国药典.一部[S].2015：11-12 ) ( 2、 中国药典. 一部[S].2 0 15：393-394 ) ( 3、 Ting W ang， Zhuju Wang， et.al. Tr a ditionaluses， botany， phytochemistry， pharmacology and t oxicology of Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen： Areview. J. Ethnopharmacol. 2016， 188：234-258 ) sciSCIENTIFIC 热线话 ww.thermofisher.com口赛默飞色谱和质谱中国 血塞通和血栓通均以三七总皂苷提取物为原料药制备而成。在2015 版药典一部中药提取物部分中，三七总皂苷提取物可以由三七根或根茎提取制备，以5 个主要人参皂苷（三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd）的含量和总量，结合HPLC-UV 指纹图谱，以相似度进行评价（相似度>0.95），来综合控制原料药的质量。但由于三七不同药用部位的人参皂苷组成并不相同，并且各生产厂家制备工艺也不尽相同，再加上药材的不同规格、产地、采收期等因素的影响，都给实际原料及其产品的质量控制和评价带来很大的挑战。本实验针对注射用血塞通和血栓通的化学物质基础，分别从RPLC-CAD 和HILIC-UV 两个分离模式下进行对比分析，结果在HILIC-UV 指纹图谱中，血栓通中PPD 单糖型的人参皂苷含量明显低于血塞通；人参皂苷Rd，Rb2+Rb3，F2( 需要MS 进一步定性) 的含量也明显低于血塞通；在RPLC-CAD 指纹图谱中，也可以得出相同结论，除此之外，RT=15.922min 的色谱峰也明显低于血塞通，此化合物需MS 进一步定性。由此可知，血塞通和血栓通虽然均以三七总皂苷为原料，但在某些微量皂苷组成和含量上差异较大，由此带来的对药效和副作用的影响仍需深入研究。