啤酒中氨基酸检测方案(液相色谱仪)

News ApplicationNews用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2021年2月400-650-0439 ApplicationNews 高效液相色谱仪 NexeraTM XR/RF-20Axs 使用自动预处理柱前衍生化功能快速同时分析多种氨基酸 01-00007-CN 大城真爱 对用户的好处 可以在一个周期24分钟内完成20种蛋白质构成氨基酸成分的分析。 通过使用 Nexera XR 配置的自动预处理功能，可以简便地进行柱前衍生化氨基酸分析。 Nexera XR 还可以完成氨基酸之外的分析，提高装置的工作效率。 前言 在食品、制药开发等各种领域都需要分析氨基酸。使用HPLC分析氨基酸，常用的方法是柱后衍生化法。本公司的氨基酸分析系统也采用了柱后衍生化法。但是，基于所使用的色谱柱的特性，柱后衍生化法存在很难实现快速分析的问题。另一方面，分析预衍生氨基酸的柱前衍生化法通过自动化衍生，比柱后衍生化法可以更快速、更简便地完成分析。 本文中为您介绍通过使用高效液相色谱仪 Nexera XR 的自动柱前衍生化法优化氨基酸分析条件的案例。 |自动柱前衍生化 Nexera XR 标配自动预处理功能。除标准的进样动作之外，还可以实现通过自动进样器稀释样品、添加试剂等各种动作。众所周知，衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(OPA) 和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)等，上述试剂在添加样品后，在室温下与氨基酸迅速发生反应。因此，使用自动预处理功能可自动完成柱前衍生化处理，减少预处理所需的时间。 此外，在本文所述的方法中，衍生化反应在自动进样器的进样针内进行，因此，和过去一样，无需另行安装反应用的试剂瓶，最大限度地减少试剂的消耗量。 图1所示为柱前衍生化氨基酸的衍生化反应简图，图2所示为使用本系统分析20种蛋白质构成氨基酸成分的色谱图。 图1柱前衍生化氨基酸的衍生化反应上：使用OPA试剂的反应 下：使用FMOC式剂的反应(本文中用于脯氨酸的衍生化) 1.天门冬氨酸2.谷氨酸3.天冬酰4.丝氨酸5.谷氨酰胺6.组氨酸7.甘氨酸8.苏氨酸9.精氨酸10.丙氨酸11.酪氨酸12.蛋氨酸13.缬氨酸14.胱氨酸15.色氨酸16.苯丙氨酸17.异亮氨酸18.亮氨酸19.脯氨酸20.赖氨酸 分析条件 标准曲线范围 表1所示为分析条件，表2所示为梯度时间程序。 表1-1分析条件 各氨基酸成分在1，5， 12.5，25， 100 (umol/L) 的浓度范围内的线性(r，相关系数)均为0.999以上，结果良好。另外，在25 umol/L下重复分析(n=10)，对面积再现性进行了评价。其结果如表3所示。 色谱柱 Shim-packTM XR-ODSII* 100 mm×3.0 mm l.D.，2.2um 模式 ：低压梯度 流动相 ： A)20 mmol/L (钠)醋酸盐缓冲液(pH6) B)水/乙乙=100：900 C)20 mmol/L (钠)醋酸盐缓冲液(pH5)，含有 0.5 mmol/L EDTA-2Na 流速 ：1.0mL/min 柱温 ：35℃ 进样量 ：1pL 样品冷却器 ：4℃ 检测器 ：荧光检测器(池温度35℃) Ch1) Ex. 350 nm， Em. 450nm Ch2)Ex. 266 nm， Em. 305 nm 表3面积再现性 表1-2分析条件(流动相配制方法) 面积(%RSD) 面积(%RSD) 天门冬氨酸 1.66 酪氨酸 1.86 谷氨酸 1.66 蛋氨酸 1.68 天冬酰胺 1.70 缬氨酸 1.61 丝氨酸 1.79 胱氨酸 1.64 谷氨酰胺 1.76 色氨酸 1.69 组氨酸 1.50 苯丙氨酸 1.63 甘氨酸 1.77 异亮氨酸 1.61 苏氨酸 1.67 亮氨酸 1.66 精氨酸 1.49 脯氨酸 5.12 丙氨酸 1.75 赖氨酸 1.89 ●流动相A 将2.67g三水合乙酸钠和41 uL醋酸加入1000 mL 纯水中。 流动相C 将0.19 g EDTA-2Na、2.03 g三水合乙酸钠和308 uL醋酸加入1000mL纯水中。 实际样品的分析 表2梯度时间程序 表2梯度时间程序 时间(分钟) A浓度 B浓度 C 浓度 0 95 5 0 0.2 93 7 0 1 93 7 0 4 87 13 0 5 0 15 85 7.5 0 30 70 12 0 35 65 14 0 45 55 14.01 0 95 5 16.99 0 95 5 17 5 95 0 18 5 95 0 图3所示为啤酒的分析例。样品使用纯水稀释至10倍或100倍，使用0.22 um 的过滤器过滤后用于分析。其中，分析条件如表1及表2所示。 mV 图3啤酒的色谱图 (上段：10倍稀释样品在 Ch1的测定结果、下段：100倍稀释样品在 Ch2的测定结果峰号参见图2) 本分析中使用的衍生化试剂的制备方法如表4所示。另外，制备后的各衍生化试剂在自动进样器内的设置位置示例如图4所示。 表4衍生化试剂配制方法 巯基丙酸试剂(MPA试剂) 将10 uL3-巯基丙酸加入 10 mL 0.1 mol/L 硼酸盐缓冲液中。 OPA试剂 将0.3 mL乙醇加入10 mg 邻苯二甲醛中并完全溶解。然后加入0.7 mL0.1 mol/L 硼酸 MPA/OPA 溶液 混合600 uL 的 MPA试剂和 300 uL的 OPA 试剂。 FMOC试剂 将 10 mg 9-芴基甲基氯甲酸酯溶解到 100 mL 乙腈中。 磷酸水溶液 将 0.5 mL 磷酸加至100 mL纯水中。 图4衍生化试剂的设置位置(例：1.5mL用样品盘) 本分析中使用的自动柱前衍生化流程如图5所示。为了执行上述动作，在自动进样器标配的自动预处理功能中的“预处理程序”模式下，按表5所示设置程序。其中，该程序设想的是各衍生化试剂按图4进行设置的情况。 图5自动柱前衍生化流程 Nexera 和 Shim-pack 是岛津制作所株式会社在日本和其他国家的商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( http：//www.shimadzu.com.cn ) 表5预处理程序详情 第2页 1 vial.n 1，54 2 n.strk ns 3 aspir 6.0，ss 4 n.drain 5 d.rinse 6 inj.p 7 s.inj 8 purge.ml mv，rs 9 purge.rp rv，rs 10 end 总结 本文介绍了使用自动预处理功能，通过柱前衍生化快速分析20种蛋白质构成氨基酸成分的案例。通过使用为 Nexera XR 优化的分析条件和预处理程序，可以简便地进行柱前衍生化氨基酸分析。此外，通过自动预处理，反应时间可以基本保持固定，实现更加稳定地分析。在本分析中使用的 Nexera XR通用性高，还可以用于氨基酸之外的分析。因此，有望提高装置的工作效率，使氨基酸分析更加容易。 编写本应用新闻时，在分析条件构建方面获得了九州大学生物防御医学研究所附属跨组学中心代谢组学马场研究室的指导与协助。 岛津应用云 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 本文介绍了使用自动预处理功能，通过柱前衍生化快速分析20种蛋白质构成氨基酸成分的案例。通过使用为Nexera   XR优化的分析条件和预处理程序，可以简便地进行柱前衍生化氨基酸分析。此外，通过自动预处理，反应时间可以基本保持固定，实现更加稳定地分析。在本分析中使用的Nexera   XR通用性高，还可以用于氨基酸之外的分析。因此，有望提高装置的工作效率，使氨基酸分析更加容易。