酒中氨基酸检测方案(液相色谱仪)

高效液相色谱分析仪 NexeraTM X3 RF-20AXS No.L592News http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439400-650-0439 ApplicationNews 利用 LC-FL自动分析酒类中37种组分的D/L-氨基酸 No.L592 岩田奈津纪 对用户的好处 ◆只需简单的操作，即可在短时间内分离和定量37种组分的 D/L-氨基酸。 ●每20个样品所需的作业时间和人力可以减少1小时以上。 ●使衍生化反应时间保持恒定，由此，可以获得重现性较高的结果。 前言 氨基酸具有L型以及D型的对映体(但是，分子内不具有不对称碳原子的甘氨酸除外)。与L-氨基酸相比，关于D-氨基酸的研究很少，D-氨基酸对食品和食材的味道、贮藏和香气等方面的作用到现在仍是未知数。然而，众所周知发酵食品和生物样品中除了许多L-氨基酸以外还含有多种D-氨基酸。由此，氨基酸的 D/L分离需求也在增加。此外，与L-氨基酸相比，D-氨基酸在食品和体内的含量微乎其微，因此需要与高浓度存在的L-氨基酸分离并进行定量。 在本文中，介绍了使用具有手性结构的衍生化试剂以反相模式分离非对映异构体形态的 D/L-氨基酸并进行荧光检测的结果。同时，还介绍了关于衍生化和分析自动化相关的内容。 手性衍生化 为了进行手性衍生化，使用了N-乙酰基-L-半胱氨酸 (NAC)和N-异丁酰基-L-半胱氨酸(NIBC) 两种类型的手性硫醇。在NAC 或 NIBC 存在下，使邻苯二甲醛(OPA)发生反应，对D/L-氨基酸进行非对映异构体荧光衍生化。 |利用LC 进行 D/L-氨基酸分析 通常，利用 HPLC分析D/L氨基酸时，由于在单一分析条件下难以分离所有的组分，因此，将使用 LC/MS 或二维 LC 等。但是， LC/MS分析易受基质效应的影响，与其他LC的检测器相比，具有定量性差的问题。此外，众所周知二维 LC 法需要进行长时间的分析。因此，需要建立一种在短时间内以简单的操作进行分离和定量的方法。 由此，系统负载压力升高，因此本文中使用了具备系统耐压130 MPa 的 Nexera X3。 分析条件和自动化讨论 表1所示是37种D/L氨基酸目标成分(在蛋白氨基酸中，D/L-脯氨酸除外)。另外，表中的背景色表示衍生化试剂的种类。也就是说，红色表示 OPA/NAC 衍生化的氨基酸，蓝色表示OPA/NIBC 衍生化的氨基酸。 图1所示为自动化系统的示意图。在本研究中，使用送液泵的流动相混合功能自动制备流动相，并且同时自动切换两种分析条件。此外，使用自动进样器的自动预处理功能进行了 D/L-氨基酸的衍生化。表2所示的两种分析条件的不同之处为流动相的有机溶剂比例和梯度时间程序(粗体部分)。使用上述流动相混合功能，只需设定有机溶剂的原液即可按照指定的混合比例输送液体。此功能不仅可用于分析，还可用于切换分析条件时所需的流动相更换，削减了人力和作业时间。此外，使用自动预处理功能，只需在自动进样器中设置装有 OPA/NAC 溶液、OPA/NIBC 溶液以及样品的小瓶，即可执行在针头内自动混合的预处理程序，因此，直接将衍生化样品用于分析(表3、4)。图2所示为工作站LabSolutionsTM 上的预处理程序设置画面。这样，通过使用自动进样器进行自动的柱前荧光衍生化，不再需要复杂的手动预处理，可以使从衍生化到开始分析的时间保持恒定。此外，由于不再需要用于衍生化的小瓶，因此可降低成本。 本次分析了20个样品，与手动操作相比，可以将总作业时间和人力减少1小时以上(表5)。另外，本文的分析可以通过图1所示的简单装置配置来实现。 表1目标成分 1 D-天冬氨酸 8 D-精胺酸 15 D-异亮氨酸 22 L-丝氨酸 29 L-酪氨酸 36 L-亮氨酸 2 D-谷氨酸 9 D-丙氨酸 16 D-苯丙氨酸 23 L-谷氨酰胺 30 L-缬氨酸 37 L-赖氨酸 3 D-天冬洗胺 10 D-酪氨酸 17 D-亮氨酸 24 L-组氨酸 31 L-蛋氨酸 4 D-丝氨酸 11 D-缬氨酸 18 D-赖氨酸 25 L-苏氨酸 32 L-(半胱氨酸)2 5 D-谷氨酰胺 12 D-蛋氨酸 19 L-天冬氨酸 26 甘氨酸 33 L-色氨酸 6 D-组氨酸 13 D-(半胱氨酸)2 20 L-谷氨酸 27 L-精氨酸 34 L-异亮氨酸 7 D-苏氨酸 14 D-色氨酸 21 L-天冬洗胺 28 L-丙氨酸 35 L-苯丙氨酸 图1流动相混合功能和自动柱前衍生化 表2分析条件 色谱柱 ：Shim-pack ScepterTM 1.9 um C8 (150 mm×3.0mm 内径， 1.9um) Shim-pack Scepter 1.9 um C8 (150mm×3.0 mm 内径， 1.9 um) 流速 ：0.6mL/min 0.6 mL/min 流动相 ：<泵A> 10mmol/L(钾)磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)* <泵B> ※ <泵A> 10 mmol/L(钾)磷酸盐缓冲液 (pH7.5)<泵B> 流动相混合 流动相混合 A)水 A)水 B)乙腈 B)乙清 C)甲醇 C)甲醇 A/B/C=15：10：75 A/B/C=10：20：70 时间程序 ：4%B (0-3 min)→11%B (13 min)→14%B (22 min)→ 25%B (30 min)→30%B (35 min)→41%B (61 min)→ 10%B (0 min)→15%B (3-15 min)→20%B (25min)→52%B (57 min)→80%B(57.01-59 min)→10%B (59.01-63 min) 80%B(61.01-63min)→4%B (63.01-67 min) 柱温 35℃ 35°℃ 进样量 ：1pL 1uL 样品瓶 ：SHIMADZU LabTotalTM 用于 LC 1.5mL，玻璃 SHIMADZU LabTotal 用于 LC 1.5 mL， 玻璃 检测波长(FL) )：RF-20AXS， Ex： 350 nm， Em： 450 nm RF-20AXS， Ex： 350nm， Em： 450nm *1 P/N：227-31034-04，*2： P/N： 227-34001-01 ※在2000mL 超纯水中加入0.68g磷酸二氢钾和2.61g磷酸氢二钾，并完全溶解。 然后添加 0.7mL 的 0.1 mol/L 硼酸盐缓冲液和4 mL 的 ① OPA/NAC 容液 4uL ① OPA/NIBC 溶液4uL ②样品1uL ②样品1uL ③混合 ③混合 ④进样方式 ④进样方式 L硼酸盐缓冲液中。 NIBC 溶液 将 20 mg N-异丁酰基-L-半胱氨酸加入10 mL 0.1 mol/ L硼酸盐缓冲液中。 OPA/NAC 溶液 混合等体积的 OPA 试剂和 NAC 溶液。 OPA/NAC 溶液 混合等体积的OPA 试剂和 NIBC 溶液。 表5自动和手动的比较(20种样品的分析) 自动 手动 流动相制备 缓冲液 5 min 有机溶剂 0 min※流动相混合功能 10 min 用切换分析条件代替流动相 0 min ※流动相混合功能 10 min 衍生试剂制备 10 min 衍生 0 min ※自动预柱衍生 50 min 总计 15 min × 85 min 标准曲线 针对37种目标组分创建标准曲线，所有组分的相关系数均在r=0.999以上，且线性良好。图4所示为部分化合物的标准曲线，表7所示为标准曲线浓度范围和相关系数。 图2预处理程序的设置画面 D/L-氨基酸标准溶液的分析 图3所示为 D/L-氨基酸标准溶液(各5umol/L)的色谱图。使用两种手性硫醇，可在总共约120分钟内分离37种组分。 图4标准曲线 重现性 对于各 2 umol/L 的标准溶液，确认了6次重复分析时的保留时间和面积重现性(%RSD)。保留时间和面积重现性的结果分别为0.1%以下和1.5%以下(表6)。 min 图3D/L-氨基酸标准溶液(各5umol/L)的色谱图 表6重重性(%RSD、n=6) 化合物 保留时间 面积 化合物 保留时间 面积 化合物 保留时间 面积 1 D-天冬氨酸 0.23 1.50 14 D-色氨酸 0.05 0.42 27 L-精氨酸 0.02 0.18 2 D-谷氨酸 0.09 0.47 15 D-异亮氨酸 0.02 0.38 28 L-丙氨酸 0.03 0.54 3 D-天冬酰胺 0.09 0.29 16 D-苯丙氨酸 0.06 0.51 29 L-酪氨酸 0.02 0.28 4 D-丝氨酸 0.10 0.19 17 D-亮氨酸 0.02 0.30 30 L-缬氨酸 0.01 0.37 5 D-谷氨酰胺 0.09 0.26 18 D-赖氨酸 0.02 0.50 31 L-蛋氨酸 0.01 0.35 6 D-组氨酸 0.07 0.40 19 L-天冬氨酸 0.35 1.32 32 L-(半胱氨酸)，2 0.02 0.62 7 D-苏氨酸 0.06 0.25 20 L-谷氨酸 0.09 0.44 33 L-色氨酸 0.05 0.44 8 D-精胺酸 0.02 0.19 21 L-天冬酰胺 0.09 0.26 34 L-异亮氨酸 0.06 0.72 9 D-丙氨酸 0.03 0.49 22 L-丝氨酸 0.10 0.19 35 L-苯丙氨酸 0.06 0.52 10 D-酪氨酸 0.01 0.28 23 L-谷氨先胺 0.10 0.29 36 L-亮氨酸 0.02 0.31 11 D-缬氨酸 0.02 0.62 24 L-组氨酸 0.06 0.40 37 L-赖氨酸 0.02 0.43 12 D-蛋氨酸 0.02 0.35 25 L-苏氨酸 0.07 0.35 13 D-(半胱氨酸) 0.02 0.38 26 甘氨酸 0.07 0.41 ※背景颜色(红色： OPA/NAC衍生化、蓝色： OPA/NIBC 衍生化) 化合物 浓度范围 (pmol/L) 化合物 浓度范围 (umol/L) 1 D-天冬氨酸 0.1-5 0.99997 19 L-天冬氨酸 2-50 0.99968 2 D-谷氨酸 0.1-5 0.99986 20 L-谷氨酸 2-50 0.99999 3 D-天冬酰胺 0.1-5 0.99992 21 L-天冬洗胺 2-50 0.99999 4 D-丝氨酸 0.1-5 0.99997 22 L-丝氨酸 0.5-20 0.99996 5 D-谷氨酰胺 0.1-5 0.99997 23 L-谷氨酰胺 0.5-20 0.99995 6 D-组氨酸 0.2-50 0.99995 24 L-组氨酸 0.2-100 0.99991 7 D-苏氨酸 0.1-5 1.00000 25 L-苏氨酸 0.1-10 0.99957 26 甘氨骏 0.5-100 0.99996 8 D-精胺酸 0.1-20 0.99994 27 L-精氨酸 2-100 0.99993 9 D-丙氨酸 0.1-5 0.99997 28 L-丙氨酸 5-100 0.99951 10 D-酪氨酸 0.1-5 0.99993 29 L-酪氨酸 2-50 0.99998 11 D-缬氨酸 0.1-2 1.00000 30 L-缬氨酸 2-50 0.99998 12 D-蛋氨酸 0.1-5 0.99999 31 L-蛋氨酸 0.1-5 0.99999 13 D-(半胱氨酸)， 0.1-5 0.99993 32 L-(半胱氨酸)， 2-50 0.99995 14 D-色氨酸 0.1-5 0.99996 33 L-色氨酸 2-50 0.99994 15 D-异亮氨酸 0.1-5 0.99990 34 L-异亮氨酸 0.5-20 0.99987 16 D-苯丙氨酸 0.1-5 0.99997 35 L-苯丙氨酸 2-50 0.99991 17 D-亮氨酸 0.1-5 0.99996 36 L-亮氨酸 2-50 0.99999 18 D-赖氨酸 0.1-5 0.99996 37 L-赖氨酸 0.5-20 0.99993 ※背景颜色(红色：OPA/NAC 衍生化、蓝色： OPA/NIBC衍生化) 应用于酒类 选用了2种啤酒、清酒和红/白葡萄酒(共5种)作为样品。将啤酒A以及清酒用 10 mmol/L盐酸水稀释5倍，将啤酒B以及红/白葡萄酒稀释10倍，然后使用 0.2 um 膜过滤器进行了过滤。 此外，仅葡萄酒中所含的成分为D-谷氨酰胺胺D-色氨酸，仅啤酒中所含的成分为D-苯丙氨酸(图5~6)。啤酒A与啤酒B相比，D-氨基酸含量相差约2倍。但是，啤酒B中D-氨基酸与D/L-氨基酸的比例比啤酒A高出约两倍。并且，已证实与L型相比，D型是微量存在的(图7~8)。 本次样品中使用的所有五种酒精类中所含的D-氨基酸为D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-丝氨酸、D-组氨酸、D-丙氨酸和D-亮氨酸。 图5酒类的色谱图 (OPA/NAC 衍生化) 图7酒类中的D-氨基酸含量 总结 使用具有手性结构的衍生化试剂，以反相模式分离非对映异构体形态的37种组分的 D/L-氨基酸并进行了荧光检测。 使用送液泵的流动相混合功能和自动进样器的自动预处理功能实现了自动化。通过自动切换并执行两种分析条件，可将流动相的制备、衍生化反应以及流动相更换所需的时间和人力共减少1小时以上(分析20个样品)。同时，能够使从衍生化到开始分析的时间保持恒定。 ※由于高浓度含有一部分L型，因此具有定量范围以外的组分。 图8酒类中的 D/L-氨基酸含量 此外，使用两种手性硫醇，可以分离酒类中的 D/L-氨基酸共37种组分。发现酒类中D-氨基酸的种类和含量在不同酒的种类中也不同。在啤酒中，D-氨基酸的含量根据种类不同而相差约两倍。并且，可以证实与L型相比，D型是微量存在的。 岛津应用云 Nexera、LabSolutions、Shim-pack Scepter、SHIMADZU LabTotal 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ( 如有变动，恕不另行通知。 ) ( 第一版发行日：2021年1月 ) 使用具有手性结构的衍生化试剂，以反相模式分离非对映异构体形态的37种组分的D/L-氨基酸并进行了荧光检测。使用两种手性硫醇，可以分离酒类中的D/L-氨基酸共37种组分。发现酒类中D-氨基酸的种类和含量在不同酒的种类中也不同。在啤酒中，D-氨基酸的含量根据种类不同而相差约两倍。并且，可以证实与L型相比，D型是微量存在的。