全血中免疫抑制剂检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-540Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-556 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 串联质谱用于全血中免疫抑制剂治疗药物监测应用 LCMSMS-556 摘要：使用串联质谱建立了全血中环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、霉酚酸5种免疫抑制剂同时测定方法。使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.997，质控品测定准确度结果与理论值接近，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于免疫抑制剂治疗药物监测。 免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等，但是由于不良反应多，常常需要在低剂量发生移植物排斥和高剂量产生毒性之间平衡。临床常用的免疫抑制剂如环齐素 A (Cyclosporine A， Cs A) 、他克莫司(Tacrolimus， TAC)、西罗莫司(Sirolimus， SRL)、依维莫司 (Everolimus，RAD-001)、霉酚酸(Mycophenolic acid， MPA) 这类药物治疗窗窄，药动力学个体差异大，需要进行治疗药物监测 (TDM))，以确保药物浓度处于安全有效的治疗范围。 本文使用超高效液相色谱三重四极杆质谱仪LCMS-8045，建立了全血中Cs A、TAC、SRL、RAD-001及MPA5种免疫抑制剂同时测定方法，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，.专属性强，可用于免疫抑制剂治疗药物监测。 输液泵： LC-40D XR×2 系统控制器： CBM-40 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST 50 mm×2.1 mm l.D.，2 um； P/N：227-30001-02；岛津(上海)实验器材有限公司 柱温：45℃ 流速：0.4mL/min 实验部分 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。具体配置为： 在线脱气机： DGU-405自动进样器： SIL-40C XR柱温箱： CTO-40C 流动相：A：0.1%甲酸水(含2mM乙酸铵)B：0.1%甲酸甲醇(含2mM乙酸铵) 进样量：5pL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为50%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.20 泵 B.Conc 50 1.00 柱温箱 CTO.RVL 0 1.30 泵 B.Conc 98 2.50 泵 B.Conc 98 2.60 泵 B.Conc 50 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 CL DL温度：250℃ 离子源： ESI(+) 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：300℃ 干燥气流速：8.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气流速：12.0L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) Cs A 1202.8 1184.8 -30 -30 -34 1219.8 1202.8 -30 -20 -34 Cs A-IS 1233.8 1216.8 -38 -20 -36 TAC 821.5 768.5 -20 -23 -40 821.5 786.5 -20 -23 -40 TAC-IS 826.5 773.5 -20 -23 -40 SRL 931.6 864.5 -22 -19 -24 931.6 882.5 -24 -15 -24 SRL-IS 934.6 882.5 -24 -15 -24 RAD-001 975.6 908.6 -20 -20 -26 975.6 926.6 -20 -26 -15 RAD-001-IS 979.6 912.6 -24 -20 -26 MPA 321.2 159.1 -25 -20 -25 321.2 207.1 -25 -10 -25 MPA-IS 324.2 210.1 -25 -10 -25 1.3标准品及样品制备 基质匹配标准曲线制备：取5种免疫抑制剂混标母液，用甲醇稀释成相应浓度混标液。内标溶液使用甲醇配置成内标工作液。取180 uL空白全血， 20uL混标液，涡旋混匀10s， 得基质标准溶液，混标基质标曲浓度见表3。 标准品及样品溶液制备：取50uL血浆标准品或样品，加入5 uL内标溶液， 50 uL 100 mM硫酸锌溶液，150uL甲醇，涡旋混匀3 min， 14000 rpm 离心5 min， 取上清液上机分析。 (如测定血浆中霉酚酸含量，前处理可不加硫酸锌溶液) 名称 L1 L2 L3 L4 L5 L6 Cs A 20 40 100 500 1000 2000 TAC 1 2 5 25 50 100 SRL 1 2 5 25 50 100 RAD-001 1 2 5 25 50 100 MPA 200 400 1000 5000 10000 20000 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 RAD-001 MPA 图11标准曲线最低点谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表4，5种免疫抑制剂在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.997，准确度在88.4%~108.7%之间，满足测定需求。 表 4 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围 (ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 Cs A Y=(0.00273844)X+(0.00485637) 20~2000 0.9988 94.2~102.0 2 TAC Y=(0.0329982)X+(-5.22501e-005) 1~100 0.9992 94.8~106.4 3 SRL Y=(0.0167088)X+(0.00347111) 1~100 0.9984 90.5~106.9 4 RAD-001 Y=(0.0111589)X+(0.00151804) 1~100 0.9980 91.0~108.7 5 MPA Y=(0.00777988)X+(0.157142) 200~20000 0.9976 88.4~108.1 2.3准确度及精密度测定结果 按1.3中的前处理方法对添加标准溶液的低中高浓度质控品进行前处理，每个浓度质控品重复制备6份，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，质控品的准确度结果如表5所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在 89%~112%之间， RSD在1.2%~8.6%之间，满足临床测定需求。 表5 质控准确度考察结果(n=6，浓度单位 ng/mL) 质控 项目 Cs A TAC SRL RAD-001 MPA LQC 理论浓度 50 2.5 2.5 2.5 500 测定浓度 55 2.6 2.8 2.7 531.4 回收率% 110 104 112 108 106 RSD% 3.1 8.2 6.7 8.6 2.0 MQC 理论浓度 160 8 8 8 1600 测定浓度 151.3 7.1 8.1 8.3 1496.2 回收率% 95 89 101 104 94 RSD% 3.1 4.5 5.1 7.3 1.2 HQC 理论浓度 1500 75 75 75 15000 测定浓度 1573.6 76.3 79.6 73.5 14295.8 回收率% 105 102 106 98 95 RSD% 2.3 2.8 3.1 1.9 2.2 结论 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用，建立了全血中环孢素A (Cyclosporine A， CsA)、他克莫司 (Tacrolimus， TAC)、西罗莫司 (Sirolimus， SRL)、依维莫司 (Everolimus， RAD-001)、霉酚酸(Mycophenolic acid， MPA) 5 种免疫抑制剂同时测定方法。使用内隹、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.997，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在 89%~112%之间， RSD 在1.2%~8.6%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于免疫抑制剂治疗药物监测。 岛津应用云 使用超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用，建立了全血中环孢素A（Cyclosporine   A, Cs A）、他克莫司(Tacrolimus, TAC）、西罗莫司（Sirolimus, SRL）、依维莫司(Everolimus,   RAD-001）、霉酚酸（Mycophenolic acid,   MPA）5种免疫抑制剂同时测定方法。使用内标、标准品及质控品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数均大于0.997，质控品测定准确度结果与理论值接近，回收率在89%~112%之间，RSD在1.2%~8.6%之间，该方法前处理简便，分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于免疫抑制剂治疗药物监测。