缬沙坦中基因毒性杂质亚硝胺检测方案(气相色谱仪)

thermoscientific 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎ 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。 顶空气相色谱-质谱法检测缬沙坦中基因毒性杂质亚硝胺 张杨刚车金水王申赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： ISQ7000 GCMS； TriPlus 500；基因毒性杂质；亚硝胺；缬沙坦 缬沙坦(Valsartan)，属于沙坦类药品，是一款血管紧张素II 受体拮抗剂抗高血压类药物，该药物通过扩张血管从而降低血 压，是多年来高血压治疗领域的主流产品，也是全球市场上最大一类抗高血压药物。2018年7月份华海制药报告其生产的缬沙坦中检测出未知杂质N-亚硝基二甲胺(NDMA)。随后欧洲药品管理局(EMA)和美国药监局(USFDA) 称NDMA可能致癌，并对缬沙坦产品启动审查和召回程序。2018年9月13日，美国食品药品监督管理局(FDA)向公众发布了关于正在进行的缬沙坦原料药杂质的最新调查结果，在三批某制药公司召回的缬沙坦药品中还存在意外的杂质N-亚硝基二乙胺(NDEA)。NDMA和NDEA均属于亚硝胺类化合物，被国际癌症研究机构2A类致癌物(对人类很可能有致癌性)。在ICH针对基因毒性杂质检测的通则M7中，这两种化合物都属于第一种(已知的、具有基因毒性(突变性)和致癌性的物质)，需控制不高于化合物可接受限度(AI)。根据FDA和EMA的规定，药品和原料药中NDMA和NDEA的限值分别为0.3 ppm和0.08 ppm， 远远低于常见基因毒性杂质的毒理学阈值TTC(1.5 ppm)。因此这两种亚 硝胺的检测，对于仪器灵敏度提出了更高的挑战。 顶空进样即静态顶空，原理是在一定的温度条件下，顶空瓶内 Partition coefficient (K)= Csample/Cgas 样品中挥发性组分向液面上部空间挥发，产生蒸汽压，在气液两相达到热力学动态平衡后，采用阀进样或者气密针进样，顶空气中的挥发性有机物经气相色谱分离，用检测器进行检测。顶空法能够有效的排除基质本底对于检测的干扰，特别适合于检测复杂基质中挥发性较强的目标物。 目前中国药监局(CFDA)和美国药监局(USFDA)均对沙坦类药品及原料药中的亚硝胺(主要为NDMA和NDEA)基因毒性杂质的检测出台了参考检测方案和征求意见稿。其中USFDA使用顶空GC-MS法检测药品中亚硝胺的方法主要有两个，分别为方法1： "GC/MS Headspace Method for Detection of NDMAinValsartan Drug Substance" [1]； 方法2： “CombinedN-Nitrosodimethylamine(NDMA)andN-Nitrosodiethylamine(NDEA) Impurity Assay by GC/MS-Headspace”[2]。方法1采 色谱柱分离， GCMS检测NDMA。方法二采用1-甲基-2-吡咯烷 酮(NMP)溶解药品后顶空GCMS进样，使用1701色谱柱分 离， GCMS同时检测NDMA和NDEA。 赛默飞新一代的Triplus 500顶空自动进样器采用创新设计的气动系统，并在顶空进样阀和GC色谱柱之间采用直接连接的方式。全新的设计给客户带来更精确的进样系统及出色的峰面积稳定性。此外，样品流量的不间断吹扫大大降低了样品及高沸点物质的残留风险，确保了系统的耐用性和数据可靠性。本方法参考上述方法，二甲亚砜(DMSO)溶解药品后，采用新一代TriPlus 500顶空自动进样器结合ISQ 7000 GCMS分析检测药品中两种基因毒性杂质亚硝胺，方法简单，灵敏度高，数据稳定可靠。 2.1仪器方法及样品处理 TRACE 1310气相色谱：分流/不分流进样口ISQ 7000单四极杆质谱TriPlus500 顶空自动进样器Chromeleon7.2数据处理系统 试剂及耗材 ( 除非另有规定，本方法所用试剂为色谱纯。载气：氦气，纯度不小于99.999% ) 标准溶液的制备 标准样品为NDMA和NDEA。称取适量后，使用DMSO(或者采用N-甲基吡咯烷酮)稀释到相应浓度。 供试品溶液：精密称取药品0.5 g， 加入DMSO溶解并定量为5mL。 灵敏度溶液：精密量取对照品NDMA，NDEA溶液适量，加DMSO定量稀释制成每1mL中约含0.03pg的溶液。 标准曲线的浓度分别为：0.03、0.05、0.1、0.2、1、2、44ug/mL， 载样量为5 mL。 仪器方法 顶空HS500自动进样器参数 孵化温度(℃) 150 孵化时间(min) 15 传输线及进样阀温度(℃) 180 进样体积(uL) 1000 振摇模式：快速(fast)； 加压模式：恒压130kPa 平衡1 min 顶空其他参数 环填充模式：恒压70kPa 平衡1 min TRACE 1310 GC系统仪器参数 进样模式：标准平衡1 min 衬管 顶空专用衬管 PN：453A1335 进样口温度(℃) 220 载气(mL/min) 1.0 分流进样分流比5：1 进样模式 分流流量 5 mL/min 色谱柱 TG-WaxMS 30m*0.25mm*0.25um PN：26088-1420 程序升温 45℃(保持1min)，15°C/min升温至180℃， 20C/min升温至250°℃(保持1min) ISQ7000 质谱仪参数 传输线温度(℃) 250 离子源温度(℃) 300 数据采集模式 Timed-SIM NDMA：6.08 min 74，42m/z 采集离子 NDEA： 6.8 min 102，57，42 m/z 1.2结果与讨论 取上述所配的标准品和供试品溶液5 mL于20 mL顶空瓶中，按照上述仪器条件进样。结果如下。 3.2.1系统适应性 USFDA规定的系统适应性为：方法的线性系数大于99.5%；药品中灵敏度LOQ NDMA优于0.1 ppm， NDEA 0.05 ppm。根据上述实验条件进样后，方法的线性曲线如下图3.1所示： 图2.1 NDMA和NDEA的线性曲线(0.03 pg/mL-4pg/mL范围) 可以看到方法在线性范围内， NDMA和NDEA的线性系数分别为99.99%和99.97%，满足系统适应性的要求。 图3.2灵敏度测试溶液(0.03ug/mL)的色谱质谱图 灵敏度测试溶液(0.03 ug/mL)的进样结果如上图3.2所示，NDMA和NDEA的信噪比分别为206.3和96.9。根据该信噪比计算得到NDMA和NDEA的检出限LOD分别为0.4， 0.9 ppb； LOQ分别为1.45， 3.1 ppb。对应到药品中的浓度分别为LOQ为0.015，0.03ppm， 优于LOQ要求的0.1和0.05 ppm。 2.2.2方法学验证 方法学验证除了上述考察的线性和灵敏度外还考察了稳定性以及实际样品回收率。 图2.3稳定性测试实验(连续6针进样50 ng/mL结果) 方法的稳定性考察了连续6针进样50 ng/mL标准样品的结果， NDMA和NDEA的RSD分别为2.38%和2.14%；均远远优于一般方法学要求的5%的要求。 实际供共品为市售缬沙坦胶囊，其中NDMA和NDEA的含量检测值为3.1ppb和未检出，换算到药品中的NDMA含量为0.031 ppm；低于规定的0.1 ppm和0.05ppm的限值要求。0.25 pg， 5 ug的加标样品的回收率NDMA分别为103%、84%；NDEA分别为92%、81%。 结论 以上测试结果证明，采用赛默飞世尔ISQ 7000气质联用仪，结合全新的Triplus 500顶空自动进样器，在药品中基因毒性杂质检测中具有灵敏度高，稳定性好的特点，完全符合国内外相关标准的需求。此外，变色龙软件的易操作性，多功能性，以及数据合规性，均为客户的方法建立和数据输出提供了高效的保障。 ·新一代顶空TriPlus 500的创新气动控制系统和样品流路的超惰性设计确保了分析结果的重复性及精确度 · ISQ 7000 具有独特的T-SIM扫描模式，无需分组即可帮助客户快速建立选择离子扫描方法 ·变色龙CDS软件完全符合医药法规安全遵循的要求，保证数据完整性、可溯性。 [1]https：//www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/UCM618053.pdf [2] https：//www.fda.gov/downloads/Drugs/DrugSafety/UCM623198.pdf 热线800 8105118 电话4006505118 www.thermofisher.com ( 所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除 非 另有指明 。 ) 缬沙坦（Valsartan），属于沙坦类药品，是一款血管紧张素II 受体拮抗剂抗高血压类药物，该药物通过扩张血管从而降低血 压，是多年来高血压治疗领域的主流产品，也是全球市场上最 大一类抗高血压药物。2018年7月份华海制药报告其生产的缬 沙坦中检测出未知杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）。随后欧洲 药品管理局（EMA）和美国药监局（USFDA）称NDMA可能致 癌，并对缬沙坦产品启动审查和召回程序。2018年9月13日， 美国食品药品监督管理局（FDA）向公众发布了关于正在进行 的缬沙坦原料药杂质的最xin调查结果，在三批某制药公司召回 的缬沙坦药品中还存在意外的杂质N -亚硝基二乙胺(NDEA)。 NDMA和NDEA均属于亚硝胺类化合物，被国际癌症研究机构 2A类致癌物（对人类很可能有致癌性）。在ICH针对基因毒性 杂质检测的通则M7中，这两种化合物都属于第1种（已知的、 具有基因毒性（突变性）和致癌性的物质），需控制不高于化 合物可接受限度(AI) 。根据FDA和EMA的规定，药品和原料药中 NDMA和NDEA的限值分别为0.3 ppm和0.08 ppm，远远低于常 见基因毒性杂质的毒理学阈值TTC（1.5 ppm）。因此这两种亚 硝胺的检测，对于仪器灵敏度提出了更高的挑战。