动物饲料中多氯代二噁英，多氯代呋喃检测方案(快速溶剂萃取)

表2. GC 与 MS条件 实际样品中 PCDD/Fs 的定量和确证分析热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.comS CIENTIFIC 应用文献10590 用搭载 AEI 源的 Thermo Scientific TSQ 9000 GC-MS/MS 气质联用系统测定动物饲料中极低含量的 PCDD/Fs 作者 Richard Law'， Cristian Cojocariu'， Paul Silcock， Chiara Calaprice Thermo Fisher Scientific， Runcorn，UK University of Liege， Belgium GC-MS/MS， 持久性有机污染物 (POPs)，灵敏度， PCDDs，PCDFs， 确证分析， TSQ 9000，AEl 源， Dionex ASE 350 加速溶 剂萃取仪 本研究测试了配备 AEI 源的 Thermo ScientificTM TSQTM 9000 三重四极杆GC-MS/MS 系统分析 PCDD/Fs 的效果， TSQ 9000 系统灵敏度高、数据重现性好，完全符合欧盟法规的定量要求。 研究简介 随着近年来气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS) 联用技术的不断发展，欧盟644/2017 和771/2017法规允许使用 GC-MS/MS对食品和饲料中的多氯代二噁英(PCDDs)、多氯代呋喃南(PCDFs)、二噁英类多氯联苯(dl-PCBs)等化合物进行确证分析，并控制其“最高水平( Maximum levels， MLs)”和“干预水平(Action levels， ALs)”。1，2气相色谱-高分辨率质谱((GC-HRMS)因其高分辨率和高灵敏度，得以从各种复杂基质干扰中分离出这些强毒性的二噁英化合物。相比而言，三重四极杆气质联用仪 (GC-MS/MS)的特点则在于其高选择性是通过“母离子一子离子”组成的特征离子对来实现的， GC-MS/MS 能够获取基本不含基质干扰的总离子流图(TICs))。 自欧盟法规规2014年允许使用 GC-MS/MS分析二噁英以来，1灵敏度往往成为显示 GC-MS/MS 在实现可靠(并符合监管要求)的二噁英及二噁英类物质确证分析的重要性能指标。除灵敏度外，常规分析中评价仪器性能还需要考虑其他因素，如：样品质量、溶剂体积、和进样量等，这些因素也将方法(和系统)在常规环境分析中的适用性。 在本研究中，我们评估了配备新型 AEI 离子源的 TSQ9000三重四极杆 GC-MS/MS系统分析溶剂标样和实际食品/饲料样品中 PCDD/Fs 的性能。本方法以EU法规规定的1/5的“最高水平(MLs)”为定量限(LOQs)，充分显示其能满足常规分析中所需的灵敏度、选择性和稳定性。 实验样品 动物饲料样品、质控样品和空白样由列日大学(Universityof Liege)提供。表1列出了样品类型、质量和所允许的最大浓度(ML)4。仪器性能测试、标准曲线和定量使用EN：1948 的标准溶液(加拿大惠灵顿实验室公司)进行分析。 样品萃取 样品制备按照此前文献描述的提取和净化方法进行。采用加速溶剂萃取技术结合离线多层酸性硅胶柱、PowerPrepM自动化系统(FMS公司)和禾三段柱(多层ABN硅胶、碱性氧化铝、活性炭)的净化方法进行样品前处理，样品最终定容在10 uL壬烷中。 本实验使用的 GC-MS/MS系统为配备 ThermoScientificTM TRACEM1310 气相的 TSQ 9000 三重四极杆质谱仪。液体样品通过具有触底进样功能的 ThermoScientificM TriPlusTM RSH 自动进样器进样分析。用全氟三丁胺(PFTBA)对对谱仪进行自动调谐和校正。 质谱仪在选择反应监测(SRM) 模式下运行，通过AutoSRM 软件对标记的和未标记 PCDD/F进行离子对和碰撞能的优化。相关的气相和质谱条件详见表2和附录A。数据的采集、处理和报告使用 Thermo ScientificChromeleonM (CDS) 变色龙软件进行。 表1.样品详情及其浓度许可“最高水平(MLs)”. 紫花苜蓿 猪油 混合样1 混合样2 羊 QC-猪油 QC-饲料(草料) 样品摄入量(g) 32.13 4.57 10.17 11.1 2.55 6.8 20.71 Regulatory ML (WHO-PCDD/F-TEQ-g)* 0.75 1 1 1 1 1 0.75** 1/5th ML (WHO-PCDD/F-TEQ/g)* 0.15 0.2 0.2 0.2 0.5 0.2 0.15 *“MLs”出自European Directive 2002/32/EC4 **使用的下限 TRACE 1310气相色谱系统参数： 进样体积(uL)： 2 衬管： Thermo ScientificM LinerGOLDTM不分流衬管(P/N：453A0924-UI) 进样口温度(℃)： 280 载气(mL/min)： He， 1.2 进样口模式： 不分流(2分钟后分流流量：120mL/min) 色谱柱： Thermo Scientific" TM- TraceGOLDTMTG-Dioxin (60 m×0.25 mm，0.25 um) (P/N：26066-1540) 升温程序： 温度1(℃)： 120 驻留时间(min)： 2 升温速率1(℃/min)： 25 温度2(℃)： 250 驻留时间(min)： 0 升温速率2(℃/min)： 2.5 温度3(℃)： 285 驻留时间(min)： 升温速率3(℃/min)： 10 温度4(℃)： 320 驻留时间(min)： 15 总运行时间(min)： 39.7 TSQ 9000 质谱仪参数： 接线温度(℃)： 300 离子化类型： EI 离子源(℃)： 300 电子能量(eV)： 50 采集模式： Timed-SRM， 驻留时间优先设置(×10-待测化合物优先级高，同位素内标优先级低) 调谐参数： AEI全调谐(默认设置) 碰撞气体及气压(psi)： 氩气，70 分辨率： 0.7 Da@ FWHM (both Q1 和Q3) 方法中分配给待测化合物的驻留时间长于同位素内标(进样内标和回收率标)。这是因为同位素标记的化合物在样品中通常的添加量比待测化合物高很多。本研究中，通过驻留时间优先分配，在确保内标物有足够的扫描时间的同时，使目标物分析拥有最高的灵敏度。 所有 GC-MS/MS 和 GC-HRMS 的对比实验，，都是基于 TSQ 9000 GC-MS/MS 上2 uL SSL 进样与WatersAutospec Premier(Milford， USA) 上5 pL PTV进样的结果进行的。 色谱分析 TraceGOLD TG-Dioxin 色谱柱能完美分离TCDD/F(图1)，，并为 PeCDD/F 分同分异构体实现了符合现行EU标准的色谱分离(图2)。 图1.TCDD/F 在 TraceGOLD TG-Dioxin (60 m x 0.25 mm， 0.25pm)柱上的色谱分离(QC进样：0.65 pg TCDF和 0.08 pg TCDD[柱上量])。上部：13C标记的2， 3， 7， 8-TCDF和2， 3， 7， 8-TCDD定性离子与定量离子的重叠谱图。下部：未标记的2，3，7，8-TCDF和2，3，7，8-TCDD 定性离子与定量离子的重叠谱图，潜在的扰扰化合物都实现了充分分离。 然而，在实际样品测试中这种方法效果并不理想，因为真实样品的测定方法必须使用多个离子对，离子比率及响应因子要求也需要满足EU标准。IDL附近浓度水平的测量结果具有不确定性，很难满足这些标准。因此，定义方法的定量限(LOQ)更为合理。 500- 图 2. TraceGOLD TG-Dioxin (60 mx0.25 mm， 0.25 pm) 柱上HxCDD/F同分异构体的的分离(CSL标样0.08 pg/uL， 柱上浓度0.16 pg)；定量离子峰高的25%以绿线标出。 灵敏度 仪器检测限(IDLs)通常可以用两种方法来确定：通过计算信噪比，或用一系列重复进样的数据来进行统计学分析。在 GC-MS/MS分析中，背景噪音通常很小，因此会使用第二种计算方式。图3显示了在 TSQ 9000 GC-MS/MS系统中通过对2，3，7，8-TCDD 溶剂标样进行重复进样(n=8)得到的IDL 表现，标样进样浓度相当于柱上5fg。 图3.柱上5 fg 2， 3， 7， 8-TCDD (321.9→258.9@20V碰撞能)多次进样的 SRM 重叠谱图。图中标出了根据n=8次连续重复进样结果计算出的仪器检测限。 为了证明三重四极杆质谱分析 PCDD/Fs 的性能， EU3指导声明： “单个化合物的定量限可以定义为...标准曲线上的最低浓度点，该浓度下测量值与基于整条标准曲线计算的平均相对响应因子之间的偏差需在可接受范围内(≤30%)且稳定(要求在一系列样品分析的最前和最后测量)。(LOQ的计算需考虑内标回收率和进样量)。” 考虑到欧盟的要求，如果分析方法能被认可，其定量限(LOQ)需要达到或低于食品或饲料ML 值的1/5。1，2同时也需要满足色谱分离度、离子比率偏差(±15%)、离子对数量(2)、和四极杆分辨率(等于或优于单位质量))1，2的标准。 因此，需要有一个浓度极低的标准品来实现标准曲线中最低浓度的点。CSL (Extended Calibration/Low Level. 见表3)标样被梯度稀释了两倍和四倍并分别加入到标准曲线中。LOQ测定的相关标准品浓度见表3， TCDD/F 和 PeCDD/F的定量和定性离子对的图谱参见图4。由于毒性当量值(WHO-TEQ) 通常表示为 pg/g 值，因此，表3中报告的LOQ 值也是以 pg 表示的。基质样品的 LOQ是考虑 TEFs和样品质量后计算得到的绝对量。 表3.LOQ一柱上绝对量，单位为 pg， 以粗体字表示。 LOQ 为工作曲线上的最低浓度点，且该最低浓度的离子比率(IR)和响应因子(RF)检测结果符合EU 要求(IR±15%， RFRSD<30%)。 123789-HxCDF 浓度 (pg/uL) / TSQ 9000 LOQ - pg 是否符合EU标准? 1234678-HpCDF EN：1948 CSL EN：1948 CSL/4 1234789-HpCDF / 0.02 / 12378-PeCDD 123478-HxCDD 0.08 123678-HxCDD 123789-HxCDD / 1234678-HpCDD 0.16 0.04 0.08 OCDD 0.16 0.04 0.32 化合物 PCDDs EN：1948 CSL EN：1948 CSL/4 TSQ 9000 LOQ- pg 是否符合EU标准? 2378-TCDF 0.04 0.01 0.02 12378-PeCDF 0.08 0.04 图4.四氯代和五氯代二噁英和呋喃 LOQ (CSL/4)的色谱图实例，分别为第4次和第61次进样，居于一个分析序列的首尾。图中数字标记为柱上绝对浓度。 表4.八点工作曲线计算出的响应因子(RF)和 RF RSD。浓度范围也已标注。 Congener Average RF from RF standard RF RSD (%) Calibration range calibration deviation (pg/uL) 2378-TCDF 1.06 0.06 5.6% 0.01-80 2378-TCDD 1.13 0.06 5.6% 0.01-80 12378-PeCDF 1.02 0.02 2.3% 0.02-160 23478-PeCDF 1.08 0.02 1.9% 0.02-160 12378-PeCDD 1.11 0.03 2.4% 0.02-160 123478-HxCDD 1.08 0.03 3.1% 0.04-160 123678-HxCDD 1.04 0.04 3.8% 0.04-160 123789-HxCDD 1.05 0.04 3.7% 0.04-160 123478-HxCDF 1.04 0.02 2.3% 0.02-160 123678-HXCDF 1.04 0.03 2.4% 0.02-160 234678-HxCDF 1.04 0.04 3.9% 0.02-160 123789-HxCDF 0.98 0.04 4.4% 0.02-160 1234678-HpCDF 1.09 0.02 1.8% 0.04-320 1234789-HpCDF 1.13 0.03 2.5% 0.04-320 1234678-HpCDD 1.16 0.08 7.3% 0.04-320 OCDD 1.15 0.05 4.5% 0.16-320 OCDF 0.99 0.06 5.8% 0.16-320 我们还额外进行了 EN：1948 CSL/4 的标样分析，以评估仪器在分析不同批次样品时的性能。在整个为时两天的分析序列中(63次进样，包括21份基质样品，11份空白样品，和31份标准品)，所有化合物的响应因子和离子比率一直都符合EU标准1和EU指引，3轻松实现高灵敏度，满足方法的定量限(LOQs)要求(图5和6)。 整个序列分析运行期间，2，3，7， 8-TCDD的离子比率即使在最低低度(柱上20 fg) 也一直稳定的保持在±15%范围内(图6a)。 图5.所有目标化合物在整个分析序列内测得的最小和最大归一化响应因子值。 a) 20fg 图6a. 2， 3， 7， 8-TCDD 的两个离子对在整个工作曲线范围内(0.01-80 pg/uL)的离子比率。 图6b.所有目示化合物在所有标样和两天分析中的离子比率。 如图所示，最小/最大IRs(蓝色箭头标出)范围处在允许的±15%公差(橙色条)之内。 一个灵敏度足够高的分析系统使得用户在样品制备过程中更加灵活。表5显示了草饲料基质样品的 LOQs(已通过样品质量和 TEF进行校准)，以及所测 QC样品的污染值。结果表，本方法具有卓越的灵敏度，方法的 LOQ低于法规要求的五倍，意味着必要情况下分析人员可以仅使用5克饲料样本来完成分析。 所有样品的分析结果都符合标准，详见表6，谱峰示例参见图7。分析的大多数样品的被污染水平都很低，许多化合物检测出的浓度为“

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