饲料中己烯雌酚检测方案(气质联用仪)

NL：3.56E5TIC MS.0104-std-4 吕建霞余翀天赛默飞世尔科技(中国)有限公司 目标 建立高效的气相色谱质谱检测方法，灵敏、快速测定饲料中的己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的含量 样品中的雌激素经乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，衍生后气质联用仪分析 引言 己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚是人工合成的非甾类雌激素，属于二苯乙烯类激素，此类激素可调节动物的生长模式，20世纪60年代起广泛作为促生长剂用于畜牧业生产，主要应用于对畜禽动物的生长催肥1-2。相对于天然雌激素，合成雌激素相对稳定，易在动物脂肪和组织内残留，进而可通过食物链危害人类健康。在20世纪90年代，此类激素在免疫毒性、遗传毒性及致癌性等方面的毒副作用得到人们的关注③，其危害涉及不同人群，其中以儿童为主，鉴于其毒副作用，1996年欧盟已公布法令禁止其在畜牧业生产中使用，2002年我国农业部亦将其列为禁用药。 目前，对于这类人工合成激素的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法去、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱串联质谱法等。气相色谱法需要衍生，操作较繁琐，杂质干扰较多，容易得到假阳性结果；高效液相色谱法灵敏度不够高；高效液相色谱串联质谱法是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统，对高沸点、不挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势，但仪器昂贵，不具有普遍性。气相色谱质谱联用法在检测 药物时具有其独特的优点，雌激素衍生后可成功分离和确证。出入境检验检疫行业标准 SN/T1744-2006《进出口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚残留量的检验方法气相色谱质谱法》即采用气相色谱质谱法对饲料中的人工合成激素进行检测。 本方法在SN/T1744-2006的基础上将样品前处理方法做了改动，将样品中的人工合成激素用乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，衍生后用气相色谱-质谱进行定性、定量。该方法定量准确，灵敏度高，重现性好，能够满足目前饲料中雌激素检测的需要。 仪器 Trace1310-ISQ气相色谱质谱联用仪，配E源(ThermoScientific)； AS1310自动进样器 (Thermo Scientific) ( 数据处理系统： Trac e finder 3.2 ) ( 恒温干燥箱、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪(Thermo Scientific) ) 耗材 色谱柱： TG-35MS (30mx0.25 mm×0.25 pm) (ThermoScientific，26094-1420) QuEChERS 产 品， 15mL 离心管包含900mg硫酸镁、150mgPSA、150mgC18(Thermo Scientific， 60105-227) 试剂与标准品 己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚标准品：含量≥99%；正己烷、乙腈、甲苯：色谱纯(Thermofisher) 衍生试剂： BSTFA+TMCS(99+1) 标准溶液的制备 储备液：准确确取10.0mg己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚标准品，分别用甲醇溶解稀释并定容至100mL，得到100mg/L标准储备液，储存在冰箱中备用。 标准中间液：上述储备液分别移取1mL，用甲醇稀释定容至50mL， 得浓度为2mg/L的混合标准中间液。 准确称取粉碎的饲料饲品3.0g，加入9.0mL乙腈，振荡提取 1min， 10000rpm 离心10min 后，取上清液6mL于另一离心管中，加入乙腈饱和的正己己溶液2mL，振荡后静置，弃去正己烷层，重复加入乙腈饱和的正己烷溶液2mL除油，弃去正己烷后，剩余的乙腈层在55℃下氮气吹干，用2mL乙腈分3次转移至 QuEChERS 净化管中。振荡1min 以充分净化样品，静置后取上清液1mL过膜， 氮气吹干。 残余物加衍生化试剂100pL溶解，混匀，封口，在70℃烘箱中衍生60min，冷却，加甲苯400pL， 混匀，供气相色谱质谱测定。 色谱柱： TG-35MS (30mx0.25mm×0.25pm)； 柱温：80℃(1min)， 20℃ /min 到 180℃ (5min)，5℃ /min 到 230℃(2min)， 30℃ /min 到 300℃ (5 min)； 进样模式：不分流进样；不分流时间：1min； 进样量：1uL；进样口温度：300℃； 载气：氦气(99.999%)，恒流模式， 1 mL/min； 质谱离子源温度：300℃，传输线温度：300℃； 扫描模式：选择离子监测模式，己烷雌酚：207*，208，179； 己烯雌酚：412*，413，383；双烯雌酚：410*，395，411 结果与讨论 样品前处理：标准方法SN/T1744-2006中采用的前处理方法步骤繁琐，需要先提取，再液液提取净化，然后还需要过 SPE小柱净化，最后衍生才能进行仪器分析。本方法采用乙腈提取，分散固相萃取的方法净化，大大节约了前处理的时间、人力、成本，步骤减少，回收率较标准方法中有较大提高。 仪器分析方法优化：标准方法中采用弱极性色谱柱分离这三种物质，分离效果不是特别理想(图1a)，本方法采用中极性的色谱柱进行分离检测，分离效果得到改善，三种物质达到基线分离(图2a)。以全扫描的方式对3种雌激素的衍生产物进行测定，得到标准品衍生产物的全扫描色谱图。对色谱峰进行谱库检索定性，定性结果各分析物出峰时间为己烷雌酚 22.89min，己烯雌酚23.12min，双烯雌酚23.63min。各组分的质谱图见图2。测定时可根据标准物和待测物的定量离子流图中的峰面积，外标法定量。确证时，可根据碎片离子及其丰度比作为其阳性判别的依据。 100- 207 50- 图2.己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚衍生物(自上而下)的质谱图 线性关系及测定低限：准确移取适量雌激素混合标准中间液，分别用甲醇稀释配制得到浓度为2、4、10、20、40 pg/L 的标准工作液，各取0.5mL氮气吹干，加入衍生试剂100pL，按上述方法进行衍生，供气相色谱质谱测定。以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图3。方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的测定低限分别为3 pg/kg、2 pg/kg、5pg/kg (SN/T1744-2006中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的测定低限分别为3 ug/kg、5 pg/kg、5 pg/kg)。 Hexestrol Y=4.169e4X-5.618e3； R^2：0.9994； Origin： Ignore； W：Equal； Area 18000000- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTM 5 0 15 20 25 30 335 40 45 回收率及精密度实验：用标准添加法，在饲料样品中，添加雌激素混合标准溶液，做加标回收实验，按上述方法进行提取、净化、衍生和测定，饲料样品添加浓度为 5pg/kg 和 10ug/kg 两个水平，各做3个平行，标准品和加标样品的谱图见图4，由图4可见，样品净化效果良好，对目标物的定量没有干扰。回收率和重复性结果见表1。 图4.标准品、实际样品和样品加标的谱图 (自上而下依次为标准品、样品、样品加标；己烷雌酚22.90min、己烯雌酚23.13min、双烯雌酚 23.64min) 表1.空白样品添加实验回收率和精密度 添加水平 (ug/kg) 5.0 10.0 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 己烷雌酚 121.0 3.4 106.5 2.9 己烯雌酚 118.3 3.7 102.5 1.8 双烯雌酚 97.9 4.1 93.1 2.8 实际样品的测定结果为己烯雌酚检出8.2ng/g，己烷雌酚和双烯雌酚未检出。 结论 ( 饲料样品中的雌激素经乙腈提取后，经正己烷除油后，分散固相萃取的方法净化，衍生后采用赛默飞世尔新型的气相色谱质谱仪检测和确证，外标法定量。结果表明，三种雌激素的平均回收率为93.1-121.0%(远高于标准 方法中的回收率66.3-100.3%)，3次平行测定的 RSD 值 ≤ 4.1%，方法测定低限为2.0-5.0n g /g(与标准方法相当)。 此法灵敏度高，能够满足饲料中雌激素的残留分析要求。 ) ( [1] Lone KP， Natural sex steroids and their xenobiotic analogs in a nimal p roduction： Growth， C aracass Quality， Pharmacokinetics， Metabolism， Mode of a ction， Residues， Methods andEpidemiology [J]. C ritical Reviews i n f o od science and nutrition， ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户) ( 1997，37(2)：93-209 ) ( [2] Steen RWJ， A co m parison of b ulls and steers imp l anted withvarious estrogenic growth p romoters i n a 1 5 -month semi-intensive system of b e ef production [J] . An i mal Pro d uction， 1985，41：301-308 ) ( [3] Inmaculada Garcia， Luis Sarabia， M Cruz Ortiz， et al. B uildingrobust calibration models for t he analysis of estrogens b y gaschromatography with mass spectrometry detection [J]. AnalyticaChimica Acta.2004， 526： 1 39-146 ) ( [4] Laitem L ， Gaspar P ， B ello l . 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