非对映异构体中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

应用文章SepaFlash@ C18反相分离柱用用于非对映异构体的分离纯化应用案例应用技术研发实验室地总 址：江苏省常州市新北区庆阳路78号销售部信箱： sales@santaitech.com机：0519-85150175销售部：400-625-6069应用技术研究中心信箱： SAT@santaitech.com 手性分子( Chiral molecules )的存在是一种自然界中的普遍现象。手性( Chirality) 一词源于希腊语中的手，就像人们的左右手不能完全重合，只能互为镜像，手性分子无论如何旋转也无法使之完全重叠。如最简单的氨基酸——丙氨酸就有两种存在形式，即：(S)-丙氨酸和(R)-丙氨酸，如图1所示，因为与中心碳原子相连的四个基团在空间的排列次序不同，造成它们具有不同的空间结构。 图1.丙氨酸对映体的化学结构式。 1848年法国化学与生物学家路易·巴斯德发现了酒石酸两种不同的存在形式，标志着有机分子手性特征的发现。直到一个多世纪之后人们才认识到手性现象不仅在动植物的生命特征中起着关键的作用，而且在制药、农业和其他化学工业领域也十分重要[1-3]。所有的蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、碳水化合物以及一些生物碱、激素等都是手性化合物[4.5]。目前临床上所用药物中约有60%是手性化合物，用于治疗的手性化合物中约88%为外消旋体药物，手性现在已经成为学术研究和制药发展的聚焦问题[6-8]。 图2.同分异构体的分类。 在立体化学中，手性分子属于同分异构体(Isomers)范畴，即互为手性的分子具有相同的分子式和不同的空间结构。如图2所示，同分异构体可以分为构造(结构)异构体( Constitutional (structural) isomers ) 和立体(空间)异构体(Stereoisomers (spatialisomers))类大类。在立体异构体中，又可以分为对映异构体(Enantiomers)和非对应异构体(Diastereomers ) 两大类。对映异构体又称为光学异构体，一对对映异构体是彼此不可重叠的镜像，对映异构体具有完全相同的物理性质，但可能具有实质上不同的生物学效应。对于对映异构体的拆分，必须依赖手性色谱柱提供的手性环境或利用超临界流体色谱技术(Supercritical fluid chromatography，SFC )才能进行[9-11]。非对映异构体是指分子具有两个或多个手性中心但不互为镜像关系的立体异构体，包括顺反异构体(cis/trans isomers)、构象异构体(Conformers)、内消旋化合物(Rotamers ) 和具有非对映关系的光学异构体。非对映异构体不仅旋光性质不同，而且很多物理性质和化学性质也不相同，因此，非对映异构体可以通过色谱或重结晶等方法进行分离。 在本应用案例中，样品来自某新药研发公司的合成实验室，为合成过程中得到的一对非对映异构体。常规的正相分离无法达到纯化目的，反相高压制备则由于其上样量限制和成本问题也不适合。因此，三泰科技的应用工程师尝试利用快速制备液相色谱仪SepaBean machine T配合SepaFlash@C18反相分离柱对样品进行分离纯化，成功获得了满足纯度要求的目标产物，为此类非对映异构体的快速制备纯化提供了经济高效的解决方案。 1.样品信息 本应用案例中样品的结构式如图3所示，其分子结构式中具有2个手性中心，图3中列出了可能存在的两种构型的结构式。 图3.样品分子可能存在的两种构型。 表1.Flash制备纯化实验参数设置。 仪器 SepaBean machine T 分离柱 25g SepaFlash⑧ C18反相分离柱，两根串关(球形硅胶， 20-45 pm， 100 A， 订货号： SW-5222-025- SP) 检测波长 220 nm；254 nm 流动相 溶剂A：水；溶剂B：乙腈 流速 15 mL/min 进样量 0.75 mL (100 mg) 洗脱梯度 时间 (min) 溶剂B(%) 0 20 56 83 95 83 100 87 100.5 100 105 100 利用HPLC对样品进行了初步的纯度分析(参见图4)，分析HPLC图谱可知，样品中的两个组分具有非常近似的保留时间，对后续的Flash制备分离提出了挑战。为了提高分离度，将多根Flash柱串联使用是一种简便易行的方法(参见三泰科技之前发布的应用案例《多根分离柱串联以提高分离度在化合物纯化方面的应用》)，在后续的Flash分离实验中，我们采取两根分离柱串联的设置，并对进样体积进行控制。 图4.粗品的HPLC分析图谱。 3.样品的Flash制备纯化 样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 结果与讨论 图5.两根分离柱串联的Flash制备模式示意图。 如图5所示，利用2根SepaFlash@ C18反相分离柱串联，以提高对样品组分的分离度。样品的Flash制备图谱如图6所示。 图6.样品的Flash分离图谱。 对收集的2个组分利用HPLC进行纯度分析(参见图7)，结果表明：纯化后收集的两个组分的纯度均达到98%以上，符合纯度要求。 图7.纯化后两个组分的HPLC分析谱图。 本案例中利用串联的2根25g规格的SepaFlash@C18反相分离柱对100 mg样品成功进行了分离纯化。在后续的方法放大中，若采用330 g规格的相同填料Flash柱，单次上样量可以达到600 mg左右，与手性分离柱或制备型HPLC相比，无疑该方法具有通量更高且成本更低等优势。 结论 三泰科技出品的SSepaBean machine配合SepaFlash@系列C18反相分离柱，可以为用户提供快速高效的样品制备纯化解决方案，助力实验室研究人员轻松完成各类样品纯化任务。 如需进一步了解SepaBean@ machine的详细规格信息，或配套使用的Flash柱订购信息，请访问CBG在线商店： https：//store.chembeango.com/. ( 1 . C. A. Challener， Chiral Drugs ， 2017 ， London： Routledge. ) ( 2. J. C. Leffingwell， Chemistry Reprint Archive Vol. 2003，5， 109- 137. ) ( 3. W. H . B rooks， W . C . Guida， K. G. Daniel， C urr. T op. Med.Chem.， 2011， 11，760-770. ) ( 4. B . Karprzyk-Hordern， Chem. Soc. Rev.， 2010， 3 9 ：4466-4503. ) ( 5. B . C. Sekhon， J Mod. Med. Chem.，2013，1： 10-36. ) 6. D. Burke， D. J. Henderson， Brit. J Anaesth.，2002， 88：563-576. 7. M. C. Nunez， M. E. Garcia-Rubino， A. Conejo-Garcia， et al，Curr. Med. Chem.，2009， 16：2064-2074. 8.L. A. Nguyen，H. He， C. Pham-Huy， Int. J Biomed. Sci.， 2006，2： 85-100. ( 9. Y . Zhang， D . R . Wu， D. B . Wang-Iverson， et al， Drug Discov. Today，2005， 10： 571-577. ) 10.E. R. Francotte， J Chromatogr. A， 2001， 906：379-397. ( 11.A. Calcatgerra， I . D'Acquarica， J Pharmaceut. Biomed.，2 0 18， 147：323-340. ) ( 真：0 5 19-85153561 ) ( 传 网 址：www.santaitech.com ) 三泰科技(常州)有限公司 ( 产品订购信箱：order@santaitech.com ) ( 技术支持信箱：support@santaitech.com ) ( 客户服务信箱：service@santaitech.com ) 实验部分1. 样品信息本应用案例中样品的结构式如图3所示，其分子结构式中具有2个手性中心，图3中列出了可能存在的两种构型的结构式。图3. 样品分子可能存在的两种构型。1. 样品初步分析利用HPLC对样品进行了初步的纯度分析（参见图4），分析HPLC图谱可知，样品中的两个组分具有非常近似的保留时间，对后续的Flash制备分离提出了挑战。为了提高分离度，将多根Flash柱串联使用是一种简便易行的方法（参见三泰科技之前发布的应用案例《多根分离柱串联以提高分离度在化合物纯化方面的应用》），在后续的Flash分离实验中，我们采取两根分离柱串联的设置，并对进样体积进行控制。图4. 粗品的HPLC分析图谱。1. 样品的Flash制备纯化样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置。仪器SepaBean® machine T分离柱25g SepaFlash® C18反相分离柱, 两根串联(球形硅胶, 20 – 45 μm, 100 Å, 订货号: SW-5222-025-SP)检测波长220 nm; 254 nm流动相溶剂A: 水;溶剂B: 乙腈流速15 mL/min进样量0.75 mL (100 mg)洗脱梯度时间 (min)溶剂B (%)0205683958310087100.5100105100结果与讨论图5. 两根分离柱串联的Flash制备模式示意图。如图5所示，利用2根SepaFlash C18反相分离柱串联，以提高对样品组分的分离度。样品的Flash制备图谱如图6所示。图6. 样品的Flash分离图谱。对收集的2个组分利用HPLC进行纯度分析（参见图7），结果表明：纯化后收集的两个组分的纯度均达到98%以上，符合纯度要求。图7. 纯化后两个组分的HPLC分析谱图。    本案例中利用串联的2根25 g规格的SepaFlash C18反相分离柱对100 mg样品成功进行了分离纯化。在后续的方法放大中，若采用330 g规格的相同填料Flash柱，单次上样量可以达到600 mg左右，与手性分离柱或制备型HPLC相比，无疑该方法具有通量更高且成本更低等优势。结论三泰科技出品的SepaBean machine配合SepaFlash系列C18反相分离柱，可以为用户提供快速高效的样品制备纯化解决方案，助力实验室研究人员轻松完成各类样品纯化任务。如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。