SepaFlash® HILIC ARG柱应用于低聚糖类样品的纯化制备 应用技术研究中心 背景介绍 低聚糖(oligosaccharide)是一类由少量(通常为3到10个[1~3])单糖分子通过糖苷键聚合而成的糖聚合物。低聚糖普遍存在于动物细胞的细胞膜,具有包括细胞识别和细胞结合等在内的多种功能[4]。例如,糖脂类分子在免疫响应过程中扮演着重要的角色[5]。在自然界中,低聚糖经常作为糖蛋白和糖脂的组成部分。低聚糖通过N-或O-糖苷键与脂类或合适的蛋白分子内氨基酸侧链结合。N-糖苷键连接的低聚糖总是这样一类五糖,其通过β键与氨基酸侧链中的天冬酰胺相连接[6]。O-糖苷键连接的低聚糖则通常与氨基酸侧链中的醇基上的苏氨酸或丝氨酸连接。 根据营养专家及许多医学研究,低聚糖有类似水溶性膳食纤维的功能,能促进肠蠕动,改善便秘、腹泻等问题。由于人体小肠只能不完全消耗低聚糖,因此低聚糖未能消化的部分会让肠道的菌落利用[7,8],因而改变肠道生态,使人体消化道菌丛生态正常化,并增加有益菌数量,帮助改善肠道的正常消化及运动,减少毒素吸收、预防肠癌、肠炎等的发生率,且能改善血脂水平。因此,低聚糖类分子在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。 在本应用案例中,样品为极性很强的某合成低聚糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,此外,其紫外吸收非常弱,不适合利用UV检测器对其进行检测。针对样品的具体性质,三泰科技的应用工程师利用SepaFlash® HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean® machine并与外接ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化制备,获得了满足制备需求的目标产物,为极性很强的低聚糖类样品的纯化制备提供了一种可行的方案。 实验部分 本案例中待纯化的样品来自从事低聚糖应用研究的某大学实验室,为合成低聚糖类化合物,样品中含有聚合程度不同的其他副产物,极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。 图1. 低聚糖类样品分子结构式示意图。 由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中,C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性或非极性样品的分离,因此我们首先考虑利用一根C18反相分离柱尝试对样品进行分离纯化。取少量样品溶于水中,利用注射器上样至Flash分离柱上,样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。 表1. Flash制备纯化实验参数设置 仪器 SepaBean® machine T 色谱柱 12 g SepaFlash® C18反相分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5222-012-SP) 12 g SepaFlash® HILIC ARG分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5622-012-SP) 检测波长 254 nm, 280 nm, ELSD 流动相 溶剂A:水 溶剂B:乙腈 流速 30 mL/min 进样量 30 mg 洗脱梯度 时间 (CV) 溶剂B (%) 时间 (CV) 溶剂B (%) 0 10 0 95 15.0 90 8.0 80 / / 15.0 80 23.0 53 25.0 53 32.0 25 37.0 25 结果与讨论 样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从Flash制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的ELSD检测器才能检测到样品的信号。 图2. 样品在C18反相柱上的Flash制备图谱。 基于普通C18反相柱对样品没有保留的实验结果,接下来我们考虑采用亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)模式对样品进行分离纯化。HILIC分离模式采用强亲水性的极性固定相,如三泰科技推出的SepaFlash® HILIC ARG分离柱,其填料表面键合有极性很强的Arg基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。在HILIC分离模式下,流动相中水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。我们利用一根SepaFlash® HILIC ARG分离柱对样品进行了分离纯化,Flash制备图谱如图4所示。分析图4可知,样品在HILIC ARG分离柱上获得了有效的保留,目标产物与副产物等杂质分离度良好。对收集组分进行TLC点板确认,采用浓硫酸/甲醇(V:V=1:5)作为显色剂,利用热风枪对TLC板烘烤15 min后,样品点的显色结果如图5所示,确认目标产物已经从副产物等杂质中有效地分离,可以应用于下一步研究开发中。 图3. SepaFlash HILIC ARG分离柱填料表面键合相示意图。 图4. 样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱。 图5. 粗品及收集组分的TLC点板实验结果。 因此,对于极性很大且无紫外吸收的低聚糖类样品的纯化制备,SepaFlash® HILIC ARG柱配合配置有ELSD检测器的快速液相制备色谱系统SepaBean® machine,为此类样品的快速制备纯化提供了一种可行的方案。 关于SepaFlash® HILIC ARG分离柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash® HILIC ARG分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 表2. SepaFlash® HILIC ARG分离柱参数 (填料:High-efficiency spherical ARG, 20 – 45 μm, 100 Å) Item Number Column Size Sample Size Max.Pressure (psi/bar) SW-5622-004-SP 5.4 g 5.4 mg – 108 mg 400/27.5 SW-5622-012-SP 20 g 20 mg – 0.40 g 400/27.5 SW-5622-025-SP 33 g 33g – 0.66 g 400/27.5 SW-5622-040-SP 48 g 48 mg – 0.96 g 400/27.5 SW-5622-080-SP 105 g 105 mg – 2.1 g 350/24.0 SW-5622-120-SP 155 g 155 mg – 3.1 g 300/20.7 SW-5622-220-SP 300 g 300 mg – 6.0 g 300/20.7 SW-5622-330-SP 420 g 420 mg – 8.4 g 250/17.2 如需进一步了解SepaBean® machine的详细规格信息,或配套使用的Flash纯化柱订购信息,请访问ChemBeanGo在线商店:https://store.chembeango.com/。 参考文献 Oligosaccharides at the US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) Walstra P, Wouters JT, Geurts TJ (2008). Dairy Science and Technology (Second ed.). CRC, Taylor & Francis. Whitney E, Rolfes SR (2008). Understanding Nutrition (Eleventh ed.). Thomson Wadsworth. Varki A, (1993). Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2): 97-130. Mattner J, DeBord KL, Ismail N, et al (2005). Exogenous and endogenous glycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections. Nature. 434: 525-529. Voet D, Pratt C (2013). Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level (4th ed.). Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0470-54784-7. Bode L (2009). Human milk oligosaccharides: prebiotics and beyond. Nutrition Reviews. 67 (2): S183–91. De Filippo C, Cavalieri D, Di Paola M, et al (2010). Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33): 14691–14696. 在本应用案例中,样品为极性很强的某合成低聚糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,此外,其紫外吸收非常弱,不适合利用UV检测器对其进行检测。针对样品的具体性质,三泰科技的应用工程师利用SepaFlash HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与外接ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化制备,获得了满足制备需求的目标产物,为极性很强的低聚糖类样品的纯化制备提供了一种可行的方案。实验部分本案例中待纯化的样品来自从事低聚糖应用研究的某大学实验室,为合成低聚糖类化合物,样品中含有聚合程度不同的其他副产物,极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。图1. 低聚糖类样品分子结构式示意图。由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中,C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性或非极性样品的分离,因此我们首先考虑利用一根C18反相分离柱尝试对样品进行分离纯化。取少量样品溶于水中,利用注射器上样至Flash分离柱上,样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置仪器SepaBean machine T色谱柱12 g SepaFlash C18反相分离柱(球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5222-012-SP)12 g SepaFlash HILIC ARG分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5622-012-SP)检测波长254 nm, 280 nm, ELSD流动相溶剂A:水溶剂B:乙腈流速30 mL/min进样量30 mg洗脱梯度时间 (CV)溶剂B (%)时间 (CV)溶剂B (%)01009515.0908.080//15.08023.05325.05332.02537.025结果与讨论样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从Flash制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的ELSD检测器才能检测到样品的信号。图2. 样品在C18反相柱上的Flash制备图谱。 基于普通C18反相柱对样品没有保留的实验结果,接下来我们考虑采用亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)模式对样品进行分离纯化。HILIC分离模式采用强亲水性的极性固定相,如三泰科技推出的SepaFlash HILIC ARG分离柱,其填料表面键合有极性很强的Arg基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。在HILIC分离模式下,流动相中水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。我们利用一根SepaFlash HILIC ARG分离柱对样品进行了分离纯化,Flash制备图谱如图4所示。分析图4可知,样品在HILIC ARG分离柱上获得了有效的保留,目标产物与副产物等杂质分离度良好。对收集组分进行TLC点板确认,采用浓硫酸/甲醇(V:V=1:5)作为显色剂,利用热风枪对TLC板烘烤15 min后,样品点的显色结果如图5所示,确认目标产物已经从副产物等杂质中有效地分离,可以应用于下一步研究开发中。图3. SepaFlash HILIC ARG分离柱填料表面键合相示意图。图4. 样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱。图5. 粗品及收集组分的TLC点板实验结果。因此,对于极性很大且无紫外吸收的低聚糖类样品的纯化制备,SepaFlash HILIC ARG柱配合配置有ELSD检测器的快速液相制备色谱系统SepaBean machine,为此类样品的快速制备纯化提供了一种可行的方案。关于SepaFlash HILIC ARG分离柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash HILIC ARG分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。表2. SepaFlash HILIC ARG分离柱参数(填料:High-efficiency spherical ARG, 20 – 45 μm, 100 Å)Item NumberColumn SizeSample SizeMax.Pressure(psi/bar)SW-5622-004-SP5.4 g5.4 mg – 108 mg400/27.5SW-5622-012-SP20 g20 mg – 0.40 g400/27.5SW-5622-025-SP33 g33g – 0.66 g400/27.5SW-5622-040-SP48 g48 mg – 0.96 g400/27.5SW-5622-080-SP105 g105 mg – 2.1 g350/24.0SW-5622-120-SP155 g155 mg – 3.1 g300/20.7SW-5622-220-SP300 g300 mg – 6.0 g300/20.7SW-5622-330-SP420 g420 mg – 8.4 g250/17.2如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息,或配套使用的Flash纯化柱订购信息,请访问ChemBeanGo在线商店:https://store.chembeango.com/。