化合物中脱盐检测方案(制备液相色谱)

产品订购信箱： order@santaitech.com： sales@santaitech.com技术支持信箱：5support@santaitech.com客户服务信箱： service@santaitech.com应用技术研究中心信箱：SAT@santaitech.com 背景介绍 反相色谱(Reversed Phase Liquid Chromatography，RPLC)是一种应用非常广泛的分离模式，从分子量很小的有机酸到分子量高达150 kDa 的蛋白质，反相色谱被应用于无数化合物的分离工作中。然而，反相色谱的应用有一个局限，就是在分析水溶性好(即亲水性强或极性大)的分析物时保留较弱，这时我们往往需要设计增加流动相中水相的比例以增加极性分析物和疏水固定相之间的作用，从而增加极性化合物的保留。分析物的极性越大，流动相中水的比例也需要更高。但是当常规反相分离柱(如最为常用的C18固定相)在纯水相或接近纯水相的流动相条件下长时间使用时，会出现分析物的保留时间逐渐或突然减少从而结果不能重现的问题。这种现象被称为固定相塌陷 (Phase collapse)[1]，对此现象较早期的解释是键合在硅胶表面的 C18固定相在纯水条件下改变了碳链的空间排布，即由原来的垂直于硅胶表面变成了类似平躺在硅胶表面(参见图1)。固定相空间排布的改变减少了其与分析物之间的作用，因此分析物的保留时间也就相应减少了。 图1.反相色谱中固定相塌陷的经典解释示意图。图中显示了长链状的键合烷基固定相在水/甲醇体系(a)和纯水相体系(b)中的空间排布状态。 随着时间推移，研究人员对固定相塌陷现象进行了深入的探索，不断积累的实验证据让许多研究者接受了另一种新的理论解释，即保留时间的减少实际是由于固定相颗粒所含的细小孔内发生的“去湿”(Dewetting)现象所造成的[2]。在新的理论解释中(参见图2)，水相和疏水固定相表面之间产生很高的表面张力，因此流动相易于被逐出布满疏水固定相的填料的多孔空间。在此条件下，固定相颗粒的孔内不再保持有流动相，因此固定相和分析物相互接触的机会也随之降低，进而造成分析物的保留时间缩短。实验证实当C18分离柱内的流动相体系从高比例有机溶剂突然转换为100%水溶剂时，流动相在色谱柱中的体积明显减低，而流动相在色谱柱内体积降低的幅度与分析物保留时间的减少密切相关[3]。 图2.反相色谱中固定相小孔去湿现象的机理示意图。在润湿状态下(a)，分析物有合适的保留；在去湿状态下(b)，分析物仅有部分保留或完全不保留。 根据 Young-Laplace公式，干燥的疏水固定相表面需要非常高的压力才能驱动水相溶剂进入其表面所含小孔中，该公式将侵入压力与液体的表面张力、液体在固定相表面的接触角等参数联系起来： 其中，AP为驱动液体进入小孔所需的压力，y为液体表面张力，d为小孔直径，0为液体与空气在固定相表面的接触角。由于纯水流动相在键合疏水固定相的硅胶表面的接触角大于90°，因此上述公式中的0小于 90°，△P为正数，所以将水挤进硅胶颗粒的小孔中需要正压力。在正常的液相分离中，将水推进硅胶颗粒孔中的压力大于流动相经过整支色谱柱硅胶表面所需的压力，因此当分离突然停止时，孔内压力大于孔外压力，水相流动相就会从疏水固定相的颗粒小孔内被排挤出来。当不经过特殊处理再次使用这支色谱柱时，由于其固定相颗粒小孔内没有被流动相润湿，固定相和分析物的相互作用大大减少，因而分析物的保留时间就出现明显的下降。然而，当固定相表面变得更亲水时，水和硅胶表面的接触角度就会减少，当此接触角小于90°，此时0大于90°，由上述公式得到进入小孔所需的压力△P变为负数，表明孔外压力大于孔内压力，此时流动相会自发地进入颗粒小孔内。这就是我们所说的“润湿”(Wetting)颗粒小孔。 从上述理论分析可知，对于普通 C18分离柱，若要改善其在高比例水相体系中固定相塌陷的状况，可以对硅胶表面进行一些亲水化修饰，包括：采用非封尾的短链烷基、在固定相中嵌入亲水或极性基团、在烷基与硅胶间插入极性基团、采用长链烷基以及采用大孔硅胶作为固相载体[4]。三泰科技出品的 SepaFlashC18AQ 分离柱中预装有亲水性 C18填料，在硅胶基质表面引入亲水的氰基(参见图3)，使硅胶表面的亲水性更强，从而可以有效防止高比例水相体系中固定相塌陷的发生。C18AQ 柱专为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系，已被广泛应用于有机酸、缩氨酸、核苷以及水溶性维生素等大极性化合物的分离纯化。 图3.普通C18柱和C18AQ柱硅胶表面键合相示意图 C18AQ 柱在 Flash 制备纯化样品中的一个典型应用是脱盐操作，即除去样品溶剂中的盐或缓冲液组分，以方便样品应用于后续研究中。在本案例中，某大极性化合物作为样品在 C18AQ 柱上进行了分离纯化，去除了粗品中所含的盐类杂质，且将样品从水相溶剂中转移至有机相体系中，从而方便了后续的旋蒸等操作，节省了溶剂及操作时间。 I实验部分 1.样品信息 本案例中所用样品为某合成反应最后一步产物，该反应如图4所示。 图4.本案例中样品的合成反应式。 由图4可知，粗品中除了目标产物之外，还有反应中使用的过量铵盐(四丁基氟化铵，分子量261)存在。为了获得满足纯度要求的目标产物，必须对样品进行脱盐处理。在色谱分离技术中，对于大分子样品，如蛋白质、多肽、核酸等，一般采用基于分子筛原理的凝胶过滤对样品进行脱盐处理。但是针对本案例中分子量仅为252 的合成小分子，凝胶过滤很难将目标分子与分子量与其非常近似的盐类杂质区分开来，必须采用其他分离模式。 2.样品的 Flash制备纯化 样品的 Flash 分离纯化实验参数如表1所示。 表1.Flash制备纯化实验参数设置。 仪器 SepaBean machine2 分离柱 12 g SepaFlash C18AQ柱 (球形硅胶，20-45pm， 100 A， 订货号： SW-5222-012-SP(AQ)) 检测波长 254 nm； 220 nm 流动相 溶剂 A： 水； 溶剂B：甲醇 X流速 15 mL/min 进样量 0.5 mL (100 mg) 洗脱梯度 时间 (CV) 溶剂B (%) 0 0 20 0 21 100 30 100 结果与讨论 本案例中所用样品具有较大的极性，易溶于水，因其极性太大在正相硅胶柱上保留太强，难以洗脱，故首先排除正相分离模式。在反相分离模式中，若采用常规C18反相分离柱，则因为起始流动相中10%以上的有机相比例的缘故，样品也会很快从分离柱上被洗脱下来，且收集组分中仍含有一定量的盐类杂质，脱盐效果不佳。因此，考虑采用亲水性的 C18AQ 柱对其进行纯化。 我们设置了台阶梯度，为了确保分子量与目标产物非常接近的盐类杂质被充分去除，维持纯水体系作为流动相运行了约20个柱体积(CV)，观察色谱图(如图5所示)可知，在纯水作为流动相时样品被完全保留在 C18 AQ 柱上。接下来将流动相中的甲醇直接提高至100%，维持此梯度运行10个柱体积，样品在约22.5至24个柱体积时被洗脱下来。收集组分中，样品溶液已从水置换为甲醇，相对于沸点更高的水溶液，显然甲醇更易于在后续的旋蒸处理中被除去，从而获得可用于下一步研究的目标产物。 图5.样品在C18AQ柱上的Flash制备纯化图谱。 与线性梯度相比，台阶梯度可以带来以下好处： 1.节省分离纯化所消耗的溶剂和运行时间； 2.目标产物的洗脱峰呈现一窄峰，降低了收集组分的体积，从而方便了后续的旋蒸处理，节省时间； 3.收集的目标产物溶于甲醇中，溶剂易于被蒸发，从而节省了产物干燥处理的时间。 关于SepaFlash C18AQ反相分离柱系列产品 三泰科技推出的 SepaFlash C18AQ 反相分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。 表2. SepaFlash@C18AQ反相分离柱参数 (填料：High-efficiency spherical C18(AQ)， 20-45 um，100A) Item Number Column Size Sample Size Flow Rate(mL/min) Max Pressure (psi/bar) SW-5222-004-SP(AQ) 5.4g 5.4 mg-108 mg 5-15 400/27.5 SW-5222-012-SP(AQ) 20 g 20 mg-0.40 g 10-25 400/27.5 SW-5222-025-SP(AQ) 33g 33 mg-0.66 g 10-25 400/27.5 SW-5222-040-SP(AQ) 48g 48 mg-0.96 g 15-30 400/27.5 SW-5222-080-SP(AQ) 105g 105 mg-2.1 g 25-50 350/24.0 SW-5222-120-SP(AQ) 155g 155 mg-3.1g 30-60 300/20.7 SW-5222-220-SP(AQ) 300g 300 mg-6.0g 40-80 300/20.7 SW-5222-330-SP(AQ) 420g 420 mg 8.4 g 40-80 250/17.2 如需进一步了解SepaBean machine 的详细规格信息，或配套使用的Flash分离柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https：//store.chembeango.com/。 ( 参考文献 ) ( 1 . Przybyciel M， Majors R E (2002). Phase collapse inreversed-phase liquid chromatography. LCGC North Am. 20(6) ： 516-523. ) ( 2.Majors RE (2013) . The top 10 HPLC and UHPLC columnmyths. LCGC North Am. 31(7)：522-537. ) ( 3.Bidlingmeyer BA， Broske AD (2004). The role of pore size and stationary phase composition in p r eventingaqueous-induced retention time loss i n reversed-phase HPLC. J Chromatogr Sci. 42： 1 00-106. ) ( 4.Majors R E， P rzybyciel M (2002). Columns for reversed-phase LC separations in highly aqueous m obile phases. LCGC North Am. 20 (7)：584-593. ) 地江机苏省常州市新北区庆阳路78号总销传网 0519-85150175 ( 售 部： 400-625-6069 ) 0519-85153561：www.santaitech.com 实验部分1. 样品信息本案例中所用样品为某合成反应最后一步产物，该反应如图4所示。图4. 本案例中样品的合成反应式。由图4可知，粗品中除了目标产物之外，还有反应中使用的过量铵盐（四丁基氟化铵，分子量261）存在。为了获得满足纯度要求的目标产物，必须对样品进行脱盐处理。在色谱分离技术中，对于大分子样品，如蛋白质、多肽、核酸等，一般采用基于分子筛原理的凝胶过滤对样品进行脱盐处理。但是针对本案例中分子量仅为252的合成小分子，凝胶过滤很难将目标分子与分子量与其非常近似的盐类杂质区分开来，必须采用其他分离模式。1. 样品的Flash制备纯化样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。表1. Flash制备纯化实验参数设置。仪器SepaBean machine 2分离柱12 g SepaFlash C18AQ柱(球形硅胶, 20 – 45 μm, 100 Å, 订货号: SW-5222-012-SP(AQ))检测波长254 nm; 220 nm流动相溶剂A: 水;溶剂B: 甲醇流速15 mL/min进样量0.5 mL (100 mg)洗脱梯度时间 (CV)溶剂B (%)002002110030100结果与讨论本案例中所用样品具有较大的极性，易溶于水，因其极性太大在正相硅胶柱上保留太强，难以洗脱，故首先排除正相分离模式。在反相分离模式中，若采用常规C18反相分离柱，则因为起始流动相中10%以上的有机相比例的缘故，样品也会很快从分离柱上被洗脱下来，且收集组分中仍含有一定量的盐类杂质，脱盐效果不佳。因此，考虑采用亲水性的C18AQ柱对其进行纯化。我们设置了台阶梯度，为了确保分子量与目标产物非常接近的盐类杂质被充分去除，维持纯水体系作为流动相运行了约20个柱体积（CV），观察色谱图（如图5所示）可知，在纯水作为流动相时样品被完全保留在C18 AQ柱上。接下来将流动相中的甲醇直接提高至100%，维持此梯度运行10个柱体积，样品在约22.5至24个柱体积时被洗脱下来。收集组分中，样品溶液已从水置换为甲醇，相对于沸点更高的水溶液，显然甲醇更易于在后续的旋蒸处理中被除去，从而获得可用于下一步研究的目标产物。图5. 样品在C18AQ柱上的Flash制备纯化图谱。与线性梯度相比，台阶梯度可以带来以下好处：1. 节省分离纯化所消耗的溶剂和运行时间；2. 目标产物的洗脱峰呈现一窄峰，降低了收集组分的体积，从而方便了后续的旋蒸处理，节省时间；3. 收集的目标产物溶于甲醇中，溶剂易于被蒸发，从而节省了产物干燥处理的时间。关于SepaFlash C18AQ反相分离柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。表2. SepaFlash® C18AQ反相分离柱参数（填料:High-efficiency spherical C18(AQ), 20 – 45 μm, 100 Å）Item NumberColumn SizeSample SizeFlow Rate(mL/min)Max Pressure(psi/bar)SW-5222-004-SP(AQ)5.4 g5.4 mg–108 mg5-15400/27.5SW-5222-012-SP(AQ)20 g20 mg–0.40 g10-25400/27.5SW-5222-025-SP(AQ)33 g33 mg–0.66 g10-25400/27.5SW-5222-040-SP(AQ)48 g48 mg–0.96 g15-30400/27.5SW-5222-080-SP(AQ)105 g105 mg–2.1 g25-50350/24.0SW-5222-120-SP(AQ)155 g155 mg–3.1 g30-60300/20.7SW-5222-220-SP(AQ)300 g300 mg–6.0 g40-80300/20.7SW-5222-330-SP(AQ)420 g420 mg–8.4 g40-80250/17.2如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息，或配套使用的Flash分离柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。