水果中多酚类营养功能组分检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-300Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-446 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测水果中常见32种酚类物质 LCMSMS-446 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定水果中常见多酚类物质的方法。该方法可完成32种水果中常见多酚类物质测定。在 0.1-2.0 mg/kg 范围内建立校准曲线，各组分线性相关系数均在0.99以上。分别对市售蓝莓、苹果进行测定，实际样品可检出多种多酚组分。 关键词：三重四极杆质谱 多酚物质 水果 植物多酚 (Plant Polyphenol) 是一大类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物。多酚类物质大体上可以分为简单酚类、酚酸类、羟基肉桂酸类和黄酮类化合物等，其中黄酮类化合物是水果种分布最广的多酚类物质，主要包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮醇类、黄烷酮类、黄烷醇类、花色苷类、查尔酮类及其衍生物等。 许多水果中都含有一定量的多酚物质，果实多酚含量也是品质评价重要指标之一。文献报道中主要采 用高效液相色谱法对水果中多酚的主要组成进行了研究，但液相色谱法由于在实际样品分析中存在基质干扰，可能会导致假阳性误判，且灵敏度不高，在低含量组分分析受限，本文采取岛津超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定水果中常见多酚类物质，有效提升检测灵敏度，减少前处理净化步骤，为水果中代谢产物分析及营养品质评价奠定基础。 实验部分 1.1仪器 岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用系统。具体配置为LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5 在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8060三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.93 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱 ： C18(150 mm×2.1 mm L， 1.8 um) 流动相 ： A相-0.5%甲酸水 B相-乙腈流速：0.3 mL/min 柱温 ：40°℃ 进样量 ：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为0%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.0 Pumps Pump B Conc. 5 10.0 Pumps Pump B Conc. 20 16.0 Pumps Pump B Conc. 25 18.0 Pumps Pump B Conc. 40 19.0 Pumps Pump B Conc. 100 20.0 Pumps Pump B Conc. 100 21.0 Pumps Pump B Conc. 0 27.0 控制器 Stop LCMS-8045质谱条件： 离子源： ESI(+)接口电压： 4 kV雾化气流速： 3.0 L/min加热模块温度：400°℃加热气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)接口温度： 300°℃干燥气流速： 10.0 L/minDL 温度：250°℃MRM 参数：见表2 表2MRM 优化参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre CE(V) Q3 Pre Bias(V) Bias(V) 1 熊果苷 497-76-7 271.1 108.10* 15 25 20 109.15 15 11 10 2 没食子酸 149-91-7 169.2 125.10* 10 15 12 79.05 20 22 11 303.20* -38 -35 -22 3- 飞燕草素-3-5-葡萄糖苷 17670-06-3 627.2 465.20 -20 -21 -18 191.20* 12 19 19 4 新绿原酸 906-33-2 353.2 179.20 18 16 19 303.15* -10 -24 -22 57 飞燕草素-3-0-半乳糖苷 197250-28-5 465.1 229.15 -30 -53 -26 303.15* -16 -25 -22 229.10 -28 -55 -25 6 飞燕草素-葡萄糖苷 6906-38-3 465.1 245.20* 16 14 16 109.05 24 24 10 7 儿茶素 18829-70-4 289.15 191.20* 13 16 12 85.10 10 41 29 8 绿原酸 327-97-9 353.2 287.15* -15 -22 -14 137.15 -15 -55 -27 9 27661-36-5 449.15 287.15* -15 -24 -21 矢车菊素-半乳糖苷 137.10 -15 -55 -14 29 檞皮素-鼠李糖苷 522-12-3 447.1 300.15* 16 25 13 301.20 22 21 21 30 异鼠李-葡萄糖苷 5041-82-7 479.2 317.10* -17 -17 -12 302.10 -30 -41 -22 31 根皮苷 7061-54-3 435.2 273.20* 12 16 18 167.15 24 29 30 32 槲皮素 6151-25-3 303.05 153.10* -26 -33 -16 229.10 -13 -30 -16 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 分别称取多酚标准品适量，用甲醇溶解，配制成1.0 mg/mL 的混合标准储备液，置于-20℃冰箱中保存。上述标准储备液用甲醇稀释得10 ug/ mL混合标准品溶液。通过逐级稀释最终配成：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ug/ mL的系列标准溶液。 1.4样品前处理方法 称取10g试样(精确到0.01 g)于50.0mL棕色离心管中，加入约20 mL 80%甲醇溶液，混合，室温下超声 15 min， 9000 r/min 离心 5 min， 上清液转入50.0 mL 棕色容量瓶中，残渣再用约15mL80%甲醇酸性溶液按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用80%甲醇溶液定容至50.0mL备用，上机前过 0.22 um 膜，并通过稀释使样品上机浓度在标准曲线线性范围内。 结果与讨论 2.1标准溶液的 MRM 色谱图 部分代表性多酚物质标准溶液 (1 ug/mL) 色谱图如下图1所示。 图1部分多酚物质标准溶液 (1ug/mL)色谱图 2.2标准曲线 按照1.3配制成各浓度混合标准工作液。。以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法绘制标准曲线，所得校准曲线在 0.1-2 ug/mL范围内线性关系均大于0.99，标准曲线线性方程及相关系数见表3. 表33校准曲线参数 序号 名称 校准曲线 相关系数R 准确度% 1 熊果苷 Y=(18223.7)X+(-73.1264) 0.9997 97.12~102.15 2 没食子酸 Y=(1.5341le+006)X+(4446.46) 0.9966 93.66~110.43 3 飞燕草素-3-5-葡萄糖苷 Y=(701937)X+(22163.7) 0.9933 85.98~112.50 4 新绿原酸 Y= (3.91195e+006)X+(10409.0) 0.9999 97.73~101.98 5 飞燕草素-3-0-半乳糖苷 Y=(2.78818e+007)X+(947312) 0.9946 87.49~113.00 6 飞燕草素-葡萄糖苷 Y=(2.01374e+007)X+(574240) 0.9964 89.33~113.22 7 儿茶素 Y=(498292)X+(8334.13) 0.9989 95.26~109.14 8 绿原酸 Y=(4.54648e+006)X+(24417.5) 0.9974 90.78~107.07 9 矢车菊素-半乳糖苷 Y=(1.14521e+007)X+(128679) 0.9992 96.77~104.61 10 矢车菊素-葡萄糖苷 Y=(1.44201e+007)X+(168561) 0.9996 97.69~103.02 11 矢车菊素-阿拉伯糖苷 Y=(2.98887e+007)X+(1.42485e+006) 0.9975 92.95~109.39 12 矮牵牛素-葡萄糖苷 Y=(445490)X+(32420.9) 0.9969 93.34~108.78 13 表儿茶素 Y=(2.44017e+006)X+(26524.4) 0.9994 96.21~105.22 14 天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷 Y=(4.28063e+007)X+(619840) 0.9998 97.51~103.62 15 二氢杨梅素 Y=(891517)X+(9529.28) 0.9946 88.40~111.76 16 原花青素C1 Y=(589506)X+(941.122) 0.9987 96.73~106.11 17 芍药素-葡萄糖苷 Y=(1.88408e+007)X+(170015) 0.9997 96.78~102.52 18 矢车菊素-木糖苷 Y=(967841)X+(47121.3) 0.9934 87.37~109.81 19 锦葵色素-葡萄糖苷 Y=(3.86006e+007)X+(277563) 0.9999 98.31~102.07 20 氯化锦葵色素--3-0-阿拉伯糖苷 Y=(1.70631e+007)X+(168086) 0.9999 97.42~102.62 21 白藜芦醇苷 Y=(1.05590e+006)X+(2335.68) 0.9987 95.35~108.27 22 芦丁 Y=(1.93805e+006)X+(73491.6) 0.9972 87.02~109.84 23 二氢槲皮素 Y=(3.02750e+006)X+(19918.7) 0.9998 95.30~102.87 24 皮素-葡萄糖苷 Y=(1.68827e+007)X+(-71123.7) 0.9998 95.52~105.00 25 木樨草-葡萄糖苷 Y=(911251)X+(3818.26) 0.9997 97.70~105.17 26 山萘酚-3-0-芸香糖苷 Y=(146109)X+(5785.79) 0.9965 88.64~111.15 27 斛皮素-阿拉伯糖苷 Y=(4.41331e+006)X+(-4379.60) 0.9996 94.50~102.96 28 异鼠李-3-芸香糖苷 Y=(40986.5)X+(576.542) 0.9981 94.82~112.16 29 皮素-鼠李糖苷 Y=(3.00895e+006)X+(6713.84) 0.9999 97.41~101.53 30 异鼠李-葡萄糖苷 Y=(515881)X+(32848.0) 0.9955 89.00~113.67 31 根皮苷 Y=(1.86455e+006)X+(-6843.00) 0.9998 96.13~103.05 32 槲皮素 Y=(2.29027e+006)X+(25192.8) 0.9995 97.15~103.20 2.3精密度实验 以3倍信噪比作为检测限，使用标准曲线最低点浓度计算最低检测限(LOD)。峰面积的重复性实验以0.5mg/L的标准样连连续进样6次，计算其相对标准偏差 (RSD)，各多酚物质最低检出限 (LOD) 及峰面积的 RSD 值见表4。 表4最最低检出限(LOD)及峰面积的RSD (%) 序号 名称 RSD%(n=6) 熊果苷 4.30 0.0126 没食子酸 3.63 0.0013 3 飞燕草素-3-5-葡萄糖苷 2.70 0.0029 4 新绿原酸 0.69 0.0022 5 飞燕草素-3-0-半乳糖苷 2.68 0.0005 6 飞燕草素-葡萄糖苷 3.56 0.0010 儿茶素 3.29 0.0293 8 绿原酸 3.83 0.0048 9 矢车菊素-半乳糖苷 1.81 0.0003 10 矢车菊素-葡萄糖苷 1.17 0.0011 11 矢车菊素-阿拉伯糖苷 1.97 0.0003 12 矮牵牛素-葡萄糖苷 3.23 0.0048 13 表儿茶素 3.79 0.0019 14 天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷 1.73 0.0004 15 二氢杨梅素 4.02 0.0080 16 原花青素C1 1.20 0.0119 17 芍药素-葡萄糖苷 1.49 0.0011 18 矢车菊素-木糖苷 3.97 0.0289 19 锦葵色素-葡萄糖苷 1.16 0.0009 20 氯化锦葵色素--3-0-阿拉伯糖苷 1.07 0.0012 21 白藜芦醇苷 4.58 0.0027 22 芦丁 4.61 0.0113 23 二氢皮素 1.34 0.0042 24 皮素-葡萄糖苷 1.55 0.0010 25 木樨草-葡萄糖苷 1.43 0.0040 26 山萘酚-3-0-芸香糖苷 4.36 0.0064 27 皮素-阿拉伯糖苷 1.87 0.0012 28 异鼠李-3-芸香糖苷 5.13 0.0146 29 皮素-鼠李糖苷 1.54 0.0017 30 异鼠李-葡萄糖苷 3.70 0.0211 31 根皮苷 2.11 0.0007 32 槲皮素 1.27 0.0015 2.4实际样品测定结果 从市场购买蓝莓及苹果样品，以1.4样品前处理方法进行样品前处理后上机分析，检出结果见表5。 表5)实际样品检测结果 序号 名称 蓝莓样品(mg/kg) 苹果样品(mg/kg) 熊果苷 1.11 2 没食子酸 0.12 3 飞燕草素-3-5-葡萄糖苷 4 新绿原酸 7.86 0.20 5 飞燕草素-3-0-半乳糖苷 63.60 6 飞燕草素-葡萄糖苷 58.00 7 儿茶素 38.88 6.22 8 绿原酸 977.00 10.28 9 矢车菊素-半乳糖苷 14.38 3.34 10 矢车菊素-葡萄糖苷 9.46 3.03 11 矢车菊素-阿拉伯糖苷 8.62 0.13 12 矮牵牛素-葡萄糖苷 49.75 13 表儿茶素 7.11 30.03 14 天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷 0.05 15 二氢杨梅素 0.44 16 原花青素C1 4.60 20.30 17 芍药素-葡萄糖苷 4.68 18 矢车菊素-木糖苷 1.14 19 锦葵色素-葡萄糖苷 106.75 20 氯化锦葵色素--3-0-阿拉伯糖苷 134.5 22 芦丁 19.48 0.09 23 二氢皮素 0.27 24 榭皮素-葡萄糖苷 7.80 0.53 25 木樨草-葡萄糖苷 26 山萘酚-3-0-芸香糖苷 1.05 27 檞皮素-阿拉伯糖苷 6.68 28 异鼠李-3-芸香糖苷 7.18 29 榭皮素-鼠李糖苷 6.38 30 异鼠李-葡萄糖苷 0.69 31 根皮苷 0.12 24.75 32 皮素 0.08 0.04 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定水果中 32种常见酚类物质的方法。该方法在27 min 内完成32种多酚物质的定量分析，校准曲线的相关系数在0.99以上。0.50 ug/ mL标准品平行测试6次，相对标准偏差在0.69%~5.13%之间。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的优势，，可用于水果中多酚物质含量检测。 岛津应用云 植物多酚（Plant Polyphenol）是一大类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物。多酚类物质大体上可以分为简单酚类、酚酸类、羟基肉桂酸类和黄酮类化合物等，其中黄酮类化合物是水果种分布最广的多酚类物质，主要包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮醇类、黄烷酮类、黄烷醇类、花色苷类、查尔酮类及其衍生物等。果实多酚含量也是品质评价重要指标之一。文献报道中主要采用高效液相色谱法对水果中多酚的主要组成进行了研究，但液相色谱法由于在实际样品分析中存在基质干扰，可能会导致假阳性误判，且灵敏度不高，在低含量组分分析受限，本文采取岛津岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定水果中常见多酚类物质，有效提升检测灵敏度，减少前处理净化步骤，为水果中代谢产物分析及营养品质评价奠定基础。