饮用水中急性毒性检测方案(水质毒性分析)

人 民 长 江Yangtze River第39卷第22期2008年11月Vol.39，No.22Nov.， 2008 杨旭光等：发光细菌综合毒性检测技术在国内的首次应用第22期41 维护健康长江 促进人水和谐 发光细菌综合毒性检测技术在国内的首次应用 杨旭光 郭文思 臧小平 (长江水利委员会长江流域水环境监测中心，湖北武汉430010) 摘要：由于地震大范围破坏的毁灭性和突发性，无法得知进入水体的污染物类型、污染范围和污染物浓度，需要一种快速、简单、准确测定水体综合毒性的技术。毒性物质可以抑制发光细菌的发光强度，通过测定发光细菌的发光强度继而测定水体的综合毒性成为一种有效方法。在简要介绍发光细菌综合毒性监测技术基本原理及应用情况的基础上，侧重总结了利用发光细菌综合毒性检测技术对四川汶川地震灾区12个市县的城镇、乡镇集中式供水水源地及灾区群众临时安置供水点的饮用水源进行应急监测的情况，并详述了该项技术在饮用水源水质中检测的特点及实际应用中需注意的事项。 关 键 词：发光细菌；饮用水源地；水质监测；地震灾区 中图分类号：P315.9 文献标识码：A 2008年5月12日，四川汶川地区发生了里氏8.0级特大地震，此次地震对灾区居民的饮水安全问题带来了严重威胁，必须对饮用水源进行监测，保障灾区居民的饮水安全。 地震灾区的水质应急监测不同于常规的水质监测，也不同于其他突发性污染事故的应急监测，由于地震的毁灭性破坏无法得知进入水体的污染物类型、污染范围和污染物浓度。在监测目标物未知的水体中，利用常规物理化学分析方法，很难确定监测的项目参数，只能选取具有代表性的水质参数进行监测；同时，灾区水源地每天供应当地居民的用水必须当天采集样品进行监测分析，这就要求监测必须准确、简单、快速，不可能按照常规饮用水水质标准，将所有的水质检测参数进行测定；此外，需要一种能够综合反映水质污染状况的检测技术来判断饮用水源是否安全。为解决上述问题，在地震灾区的水质检测中，引进了发光细菌综合检测技术。发光细菌综合毒性技术是环境样品毒性检测的生物测试技术，已被列入德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348)。近年来，利用发光细菌综合毒性技术检测环境污染物综合毒性在国内外备受关注。1995年，该技术被列为国家标准《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB/T15441一1995)，并由中国标准出版社出版。该检测技术已经广泛应用于测试化学品、污水、沉积物和土壤等的毒性，能够在短时间内反映水质的综合毒性状况，同时，对检测结果进行评价，判断水体是否适于作为饮水水源。 在地震灾区饮用水源的应急监测中，长江流域水环境监测中心应用发光细菌综合毒性检测技术，利用移动监测车在监测常规理化指标的同时，使用 Deletox(便携)或 Microtox(台式)检测系统，检测了汶川地震灾区12个市县的200多个城镇、乡镇集中式供水水源地及灾区群众临时安置供水点的饮用水源水质 综合毒性状况，对检测结果进行评价，为灾区人民的饮水安全提供了安全保障。 1 发光细菌综合毒性检测技术 发光细菌综合毒性检测技术是生物活体检测技术的一种，它是利用发光细菌检测样品的综合毒性。发光细菌在进行新陈代谢时会发出光，而毒性物质能抑制或阻止其正常代谢，导致发光强度的改变，毒性越强，对代谢的抑制作用越强，发光被抑制得越厉害，所以可以通过检测发光细菌光强的改变来测试水体的综合毒性。 1.1 发光细菌的种类浓度 发光细菌属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，最适生存温度20~30℃；6~9的 pH 值，3%NaCL、0.3%的甘油对发光很有利。目前，已发现和命名的发光细菌分别属于弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)和异短杆菌属(Xenorhabdus)2。常用于环境毒性监测的发光细菌有3类，分别为费氏弧菌、明亮发光杆菌和青海弧菌。 1.2 发光细菌综合毒性检测原理 发光细菌综合毒性检测技术是建立在细菌发光生物传感方法基础上的毒性检测技术，它能有效地检测突发性或破坏性的水源污染。该方法使用了具有发光特性的天然微生物并充分利用了微生物新陈代谢时发光的特点。其反应机理是发光细菌体内的荧光素酶催化荧光素的氧化作用，如下列化学方程式所示3： 生物发光直接与细胞的活性及代谢状况相关。毒性物质将 ( 作者简介：杨旭光，男，长 江 水利委员会长江 流 域水环境监测中心，工 程 师。 ) 改变细胞的状态，包括细胞壁、细胞膜、电子转移系统、酶及细胞质结构，这些变化最终将导致生物发光的减弱。通过生物发光光强度的测定即可计算得到样品毒性的强弱。 简单地讲，就是发光细菌在进行新陈代谢时会发出光，若正常代谢被抑制，就会导致发光强度减弱。毒物能抑制甚至阻止正常代谢，当发光菌和水样混合后，水样中的毒性物质会影响发光菌的新陈代谢，发光强度的减弱与样品中毒性物质的浓度成正比。 1.3 发光细菌综合毒性检测系统 发光细菌综合检测仪器一般是带有光电倍增管和记录仪等配套的测光仪，内部可控温，用来测定发光细菌的发光强度，目前，主要有 Deletox(便携)或 Microtox(台式)发光强度检测系统。 发光细菌综合检测是通过 Deletox(便携)或 Microtox (台式)两种分析测试系统完成水体样品的测试。测试过程为，将冻干的发光细菌制剂经过复苏培养后，使其发光强度达到相对稳定，取一定体积的复苏培养好的菌液至样品中，凭借 Deletox(便携)或 Microtox(台式)分析系统测试样品加入菌液前后的光强，通过发光细菌的光强变化，从而反映水体的综合毒性状况。 1.4 发光细菌综合毒性检测技术的发展 国际上， Bulich. A. A 20 世纪70年代末已经研究了利用海洋发光细菌冻干制剂，凭借 Microtox 分析仪器检测样品毒性，检测结果显示，发光细菌在 Microtox 分析仪器中的发光强度随样品中毒性物质总体浓度的增大而呈线性降低的负相关性4，80年代初，美国Beckman 公司推出功能完备的生物毒性测试仪，它具有应用范围广、灵敏度高、相关性好、反应速度快等优点。发光细菌毒性测试技术在世界范围内得到迅速推广。有报道称I5，美国在1984年洛山矶和1996年亚特兰大奥运会期间、1991年海湾战争以及2000年民主党全国代表大会期间都采用了该方法对饮用水的处理和分配系统进行连续的监测，以保证饮水的安全。 2 在地震灾区水质监测中的应用 国内的发光细菌综合毒性检测技术的研究大多数是在实验室条件下，进行发光细菌的发光特性、影响因素及毒性效应等的相关研究；在环境监测中的应用还处于初级阶段，在实际的环境检测中，一般用于工厂、企业排污口、河流断面、底泥等方面，很少应用于饮用水源的应急监测。而在四川汶川地震期间，长江流域水环境监测中心首次应用发光细菌毒性检测技术，对灾区饮用水源的水质进行了应急监测，准确无误地检测了水体的综合毒性效应，保证了灾区居民的饮水安全。长江流域水环境监测中心水质巡回检测的主要对象为地震灾区各城镇、乡镇集中式供水水源地及灾区群众临时安置供水点的饮用水源水，主要包括：成都、都江堰、彭州、温江、崇州、郫县、大邑、江油、什、绵竹、雅安(汉源和宝兴)等12个县市。同时，在一些地区的饮用水源水出现异常时，巡测人员赶赴现场进行相应的复核检测工作. 在实地监测期间，采取固定监测和移动监测相结合，利用Microtox 和 Deletox 检测系统检测费氏弧菌的光抑制率，通过计算，直接测定样品的综合毒性；同时，进行了水质理化指标的监测，主要包括水温、pH值、电导率、浊度、氨氮、亚硝酸盐氮、CODMn、六价铬、氰化物和氟化物等参数。在一个月的饮用水源 地巡回检测中，同兄弟监测中心一道共检测水样1000多个，获取监测数据上万个。结果显示，大部分水源水质较好，未出现异常现象，水体的综合毒性指标正常。 2.1 综合毒性检测技术的特点 2.1.1 操作简单、方便快捷 地震灾区的饮用水源地分布较广且分散，不可能携带大型分析仪器巡回于各水源地之间，而 Deletox 检测系统小巧轻便，自带的内置电池可供连续工作8h，也可外接电源工作；同时，发光细菌置于用冰块冷却的保温箱中，可保存48 h， 随时可用于水质检测工作；另外，可以移动监测车，将车内温度可设置为10~28℃，保证检测系统良好的操作条件。 Deletox 检测系统不仅携带方便，操作简单，而且测试快速。在都江堰紫坪铺镇的白沙河断面、都江堰南桥以及彭州市丹景山镇的关口水库、彭州和雅安等地都进行现场取样，同时，在野外，以移动监测车为操作平台和供电系统，利用发光细菌(费氏弧菌)综合毒性检测技术，凭借 Deletox 系统行行现场检测、分析及评价，检测一批样品(n≤20)从准备工作、取样、分析以及评价的时间仅需大约40 min，大大缩短了水样的检测分析时间。 2.1.2 能够反映水体的综合毒性效应 在地震灾区饮用水源检测过程中，综合毒性检测技术能够很好地反映水体的综合毒性效效。在2008年6月7日，对四川安县和三合镇两个地下水源进行检测，综合毒性检测结果显示，不宜作为饮用水源，同时，监测的化学需氧量指标也显示异常。实地调查的结果表明，由于地震原因，其中一个地下水源被旁边的养畜废水渗入，导致水源被污染。在其他多数饮用水源的水质监测中，综合毒性检测技术检测评价结果为水质正常，而相应检测的理化指标为未检出。然而，在地震灾区，有些饮用水源为地下水井，水体中的铁、锰含量较高时，在理化指标监测有限的情况下(未监测铁、锰水质指标)，综合毒性检测技术依然能够检测出水体综合毒性指标异常，因此，能够很好地说明，无论水体是否遭受有毒物质的污染，或是污染程度严重与否，或理化指标无法监测的情况下，综合毒性检测技术都能够很好地反映水体的综合毒性效应。 2.2 在水质检测应用中应注意的事项 2.2.1 水体中消毒剂的影响 水体中存在一些以余氯成分为主的消毒剂会影响发光细菌的发光强度，造成检测结果的异常。例如：在地震灾区，当地部门对地下饮用水源进行消毒，导致水中含有较多含氯消毒剂，会影响综合毒性检测结果。在每天的水样检测中，均伴有含氯消毒剂干扰检测结果，利用化学方法测定余氯，结果含量约在0.5~0.7 mg/L，而其他的理化参数均正常，此时，可以选用10 g/L的硫代硫酸钠溶液进行脱氯处理。 2.2.2 色度和浊度的影响 发光细菌综合毒性检测技术主要是利用 Deletox(便携)或Microtox(台式)检测系统，检测发光细菌在进入水样前后，光强的变化程度来反映水质的综合毒性，而水体中的色度和浊度恰恰是影响光通过检测池，最终影响分析结果。2008年6月7日，在四川汶川的漩口镇，余震将一口地下水井震浑，水中有大量悬浮物，而综合毒性检测结果显示异常，在理化指标中，除浊度显示异常外，其他理化指标均正常，后来将水样过滤后，再进行重新测试，综合毒性检测评价结果显示正常。 2.2.3 水样pH的影响 有研究表明I5，pH值在6~9时，发光细菌存活率最高，发光率最大，显示的水体毒性较轻。也有学者研究了不同pH值对发光细菌发光度的影响，结果显示，当pH在5~9时，发光细菌发光度基本稳定，当pH低于5或高于9时，发光细菌发光度迅速降低1。本次在地震灾区的水质应急监测中，水源水的pH 值均为6~9，完全适合发光细菌综合毒性检测技术的应用，若水样的 pH 为6~9，可以利用 HCL 或 NaOH 进行调节。 2.3 应用建议 2.3.1 现场和固定监测方式结合 在地震灾区的水质监测中，每天所检测的水源地不同，样品的数量不同，如果移动监测车无法抵达水源地，而样品又较少，可以在现场进行测试；如移动监测车可以抵达水源地，或者样品较多，现场无法完成分析，则应带回移动监测车检测分析，这就需要利用综合毒性监测技术对 Deletox 检测系统和 Microtox 检测系统进行有机的结合检测。 目前，市售的发光细菌的包装分为两种，一种为小盒菌，一只可测定1~2个样品；另一种为大盒菌，一只可可定100个样品，拆开后，必须低温保存，免遭失活。 Deletox 检测系统轻便小巧、携带方便，主要用于水样的现场检测，检测数量灵活。 Microtox 检测系统属于台式仪器，携带不便，放于临时实验室，用于固定检测，系统有冷却装置，当天使用时，可以保证拆开的大盒发光细菌免遭失活，专门用于大批量的样品检测分析，节省费用。若现场只需做很少几个样品时，可以利用 Deletox 检测系统进行水质的检测，而样品较多时，便可利用 Microtox 检测系统在临时固定实验室检测分析。 现场和固定监测方式相结合，灵活应用，即可节省检测时间，又可有效利用菌种，节省费用。例如，2008年6月3日，在都江堰地区仅采集了6个样品，直接利用 Deletox 检测系统，在现场花费约40 min 完成水样的综合毒性检测分析；而2008年5月20日，在彭州地区，受灾居民当天采集了100多个来自不同水源地的源水样品，必须当日检测分析结果，由于样品太多，利用Deletox 检测系统，现场根本无法完成，只能利用 Deletox 和Microtox 检测系统相结合进行分析，在现场利用 Deletox 做了部分样品的检测工作，立即回到临时固定实验室完成了剩余的样品分析，两种检测系统的结合，不仅在当天有效地检测了水源地的水质污染状况，而且，节约了检测时间和成本。 2.3.2 综合毒性检测技术与理化检测技术相结合 综合毒性检测技术能够很好地检测水质的综合毒性效应，并不代表能够替代常规的理化检测方法，两种检测方法各有优势，水体中的综合毒性效应可以同时综合反映一种或多种化学品的浓度、生物有效性及其生物体本身的毒性，还可以反映水体 中各种效应的相加、协同和拮抗作用，但是，很难根据综合毒性效应来确定产生毒性效应的原因，更不能确定是哪种物质造成的水环境毒性效应。因此，将综合毒性检测技术与有目的的理化技术相结合是解决应急监测问题的最佳方案。 本次地震灾区的水质应急监测就是将综合毒性检测技术和理化检测技术相结合，在利用发光细菌综合毒性检测技术的同时，对水样的理化指标进行分析，包括水温、pH值、电导率、浊度、氨氮、亚硝酸盐氮、COD、六价铬、氰化物和氟化物等，有效地保证了数据的真实性和准确性。 3 小结与展望 发光细菌综合毒性检测技术首次大规模地应用于饮用水源的应急监测中，该技术操作简单、方便快捷，能够快速反映水体的综合毒性效应，已经成功应用于国内外大气、水和土壤等各领域研究中。若能与有目的物化检测技术相结合，不仅可以反映水体的综合毒性效应，同时，还可以掌握水体综合毒性效应的原因，从而，全面了解水环境的污染状况。本次地震灾区水源地综合毒性检测技术和理化检测技术结合的应急监测方式，就是一个很好的例子。同时，目前发光细菌综合毒性检测技术通过人工进行检测，今后可以考虑在水源地、工厂企业排污口等设置在线发光细菌检测装置，实时在线监测水质综合污染状况，为环保事业的决策者提供基础数据支持。还有，需要进一步研究探讨各类污染物对不同发光细菌发光强度的抑制程度，分辨出水体中是哪类污染效应占主导因素。最后，应根据受试菌种的不同，完善利用发光细菌进行的毒性综合检测技术的评价标准，以便研究具有可对比性。 ( 参考文献： ) ( [1] 方战 强，陈 中豪，胡勇有. 发光 细 菌 在 水 质监 测 中 的应 用.重庆 环 境 科学 ， 20 0 3，25(2)：56~ 58 . ) ( [2] J ohn G H olt， N oel R Krieg， Peter H A Sneath et a1 . Bergeys Man - ua l of Determi n ative B acteriology ( Ninth Edition ). Williams &Wilkins Baltimore，USA， 1994：7~3 7 7. ) ( [3] 王安 平 ，朱文杰，郑 幼 霞.东方 弧 菌 荧光 酶的 分离纯化和性 质研 究. 发光学 报， 1993，14(3)：292~ 2 95. ) ( [4] Vasseur P e t a I . Luminecent mar i ne bac t e ria in a c t iv e t o xicity te s -ting. Interna t ional symposi u m o n E c otox i cological T e stin g for t h eMari n e E nvironment， G hent chelgium， 1 9 93，12(9). ) ( [5] 凌云 . 毒 物 对 发光 细 菌 发 光 率的 影 响.化学工 业与 工 程 技术 ， 2000，21 ( 1 ) ：31 ~3 2. ) ( [6] 王丽 莎 ，魏东 斌 ，胡洪营 . 发 光 细菌 毒性测试 条 件的优化与 毒性 参 照 物 的 应 用.环境 科 学 研究，20 0 4 ，17(4)：61~63. ) ( [7] 韩 润平，余卫鸿 ，蒋海 涛 . 利 用生物毒 性 仪 进行 水 质 监 测 的 探讨 . 遵义师 范学 院 学报，2 0 0 7，9(1)：65~67. ) ( (编辑 ：常汉生) ) 新冠疫情下的饮用水水源地生物毒性应急监测方案新型冠状病毒感染肺炎疫情牵动人心。自1月31日生态环境部印发的《应对新型冠状病毒感染肺炎疫情应急监测方案》中将生物毒性明确列为饮用水水源地疫情防控特征指标之一以来，我们接到了许多用户关于Microtox® FX 和Deltatox II便携式毒性仪在应急监测中使用的咨询。在此次新冠疫情期间，Modern Water时刻关注饮用水安全，随时待命准备为您提供产品应用支持和售后服务。我们特别收集并整理了一批应急用户最为关心的问题，在本篇文章中逐一进行解答。01使用Microtox® FX 或Deltatox II分析仪进行饮用水水源地应急监测时如何选择分析模式？建议选择81.9% B-Tox模式进行检测。由于饮用水水源地的水质较好，样品中通常不含污染物质，进行应急检测时无需对样品进行额外稀释；选择B-Tox模式，对样品和发光细菌接触前/后分别进行一次读取并计算抑制率（光损失，Light Loss），根据结果可以直接对样品毒性水平进行评价，兼顾了检测速度和精确度。02应急监测时的操作步骤是否简便？Microtox® FX 和Deltatox II是便携式毒性分析仪，仪器自重约1kg，可以携带至任意地点进行应急监测，最快15分钟内可以获得测试结果。详细操作步骤（使用Microtox®FX便携分析仪，81.9% B-Tox模式下单个样品）请参见演示视频。03如何进行多样品测试？如果需要对一批多个样品进行测试，只需在单样品操作步骤基础上加入下列步骤：发光菌复苏：每增加2个待测样品，须另开启1支Microtox SOLO发光菌试剂并用300μL稀释液复苏。将所有复苏后发光菌并入一个试管中并用移液器混合；样品准备：如样品数量为n，向试管架中放入的试管数量为2n+2。向A2-An每个试管中各加入1000μL样品和100μL渗透压调节液（OAS）。向B2-Bn试管中各加入100μL复苏后发光菌；样品读取：B2试管初次读取完毕后，请在仪器屏幕上选择Read Sample: 2（读取样品2）并将B3试管放入仪器进行读取；重复该步骤对每个待测样品对应试管（B3-Bn）进行读取，完成后选择Done开始反应计时；此时从A1-An每个试管中各移取900μL至B1-Bn中；反应完毕后，依次对B1-Bn试管再次进行读取，仪器将自动显示每个样品的测试结果；在81.9% B-Tox模式下，仪器支持最多一批10个样品同时检测，一般可在20分钟内完成整批样品的测试。04样品是否需要预处理？饮用水水源地原水：通常无需进行任何预处理，可将样品直接加入试管中开始分析；出厂水或自来水终端水：这类水样中通常含有一定浓度的余氯。作为一种消毒剂，余氯对测试使用的发光细菌有抑制作用。因此，为了排除测试结果中余氯的影响，需要使用硫代硫酸钠溶液对待测样品进行除氯后再进行分析。除氯步骤：按1：100的比例向待测样品中加入1%硫代硫酸钠溶液，混合均匀。05分析结果的毒性水平如何评价？按照《污水生物毒性监测技术规程 发光细菌急性毒性测试-费歇尔弧菌法》中规定，根据15min的发光抑制率大小对样品毒性水平进行评价，毒性等级分为3 级，相应等级分别为低度毒性风险、中度毒性风险、高度毒性风险，分级方法见下表。Modern Water 作为先进水质生物毒性监测设备的所有者，所有用的Microtox®生物毒性检测技术起源于20世纪60年代，是生物毒性检测行业内的“黄金标准”。这项技术应用生物传感原理（发光细菌法），可对水中广谱污染物质进行快速测定。Microtox® 系列生物毒性分析仪自2007年进入中国以来，广泛应用于水源地、净水构筑物出水、出厂水的应急监测，在环境监测、供水、疾控和公共卫生管理等领域中发挥了重要作用。