多肽混合物中分离纯化检测方案(液相色谱仪)

上海通微分析技术有限公司Unimicro (Shanghai) Technologies Co.， Ltd.Application NoteAN0425-QT0046 基于高效微流电动液相色谱系统分离检测强阳离子交换亲水性多肽 1.背景介绍 毛细管电色谱(CEC) 是一种集高效液相色谱 (HPLC)的高选择性和高效毛细管电泳(CE)为一体的小型液相色谱技术。自1974年第一次报道 CEC 以来，随着理论和应用的发展， CEC已成为一种强大的分离技术。然而，这种技术的发展速度受到了实际问题和困难的阻碍，主要包括色谱柱的制造，再生和仪器有关。在“纯”CEC中，由于焦耳加热，经常遇到形成气泡和干涸的问题。并且因其没有注射阀，难以实现样品的定量注射。 为了减少气泡的形成，HPLC泵已经与 CEC 系统相耦合，最终形成一种被称为高效微流电动液相色谱系统(eHPLC)的混合技术。在这种新颖的分离技术中，压力和电场都可以施加在填充的毛细管色谱柱上，有利于中性和带电物质的分离。此外， eHPLC可实现溶剂的梯度洗脱和定量注射。 我们研制的eHPLC系统，，可用于高效微流电动液相色谱、微流液相和毛细管电泳等实验。并研究了 eHPLC 在亲水性和强离子交换混合模式下多肽的分离。对于多肽等带电物质， eHPLC模式下的保留机制是基于色谱分离和电泳迁移。因此，，可以通过改变电场和压力来调节多肽的洗脱。并且我们评价了亲水性相互作用、离子交换和电迁移对多肽分离的贡献，并讨论了保留机制。用梯度洗脱法分离 eHPLC 系统中的多肽，研究了压力、电场、有机溶剂、pH值、离子强度等因素对多肽混合物分离的影响。 2.测试条件 仪器： TriSep @-3000高效微流电动液相色谱系统 3.测试结果 图1 eHPLC 系统分离检测多肽 注： 1Met-Met；2 Gly-Leu； 3 Leu-Gly-Gly； 4 Gly-Cys； 5 Gly-Gly-Gly。 A CE：； BRP-eHPLC； C SCX-eHPLC. 图2 eHPLC 系统中压力对物质保留性的影响 图3 eHPLC 系统中施加电压强度对物质保留性的影响 Acetonitrile (%) 图4 eHPLC系统中有机溶剂浓度对物质保留性的影响 图5 eHPLC系统中离子强度对物质保留性的影响 图6 eHPLC系统中等度洗脱和梯度洗兑6种多肽的比较 注：A等度(75%乙腈)；B等度(50%乙腈)；C梯度。 4.结论 采用 TriSep @-3000 高效微流电动液相色谱系统，可以通过改变外加电压和压力来调节多肽等带电化合物的选择性，克服了纯 CEC 中形成气泡的问题。系统的研究了压力、电 场、有机溶剂、pH值、离子强度等因素对多肽混合物分离的影响。实验结果表明，高效微流电动液相色谱系统，可方便地进行连续梯度洗脱，并可通过液相型注射阀实现定量注射。并且是分离亲水性多肽的一种有效方式。 5.配置列表 仪器配置 TriSep -3000 高效微流电动液相色谱系统(配二元梯度泵、柱温箱、UV检测器、高压电源、自动进样器、微流控、控制器) Clarity Lite 色谱工作站 www.unimicrotech.com.cn TEL： E-mail：info@unimicrotech.comcn        毛细管电色谱（CEC）是一种集高效液相色谱（HPLC）的高选择性和高效毛细管电泳（CE）为一体的小型液相色谱技术。自1974年第一次报道CEC以来，随着理论和应用的发展，CEC已成为一种强大的分离技术。然而，这种技术的发展速度受到了实际问题和困难的阻碍，主要包括色谱柱的制造，再生和仪器有关。在“纯”CEC中，由于焦耳加热，经常遇到形成气泡和干涸的问题。并且因其没有注射阀，难以实现样品的定量注射。       为了减少气泡的形成，HPLC泵已经与CEC系统相耦合，最终形成一种被称为高效微流电动液相色谱系统（eHPLC）的混合技术。在这种新颖的分离技术中，压力和电场都可以施加在填充的毛细管色谱柱上，有利于中性和带电物质的分离。 此外，eHPLC可实现溶剂的梯度洗脱和定量注射。       我们研制的eHPLC系统，可用于高效微流电动液相色谱、微流液相和毛细管电泳等实验。并研究了eHPLC在亲水性和强离子交换混合模式下多肽的分离。对于多肽等带电物质，eHPLC模式下的保留机制是基于色谱分离和电泳迁移。因此，可以通过改变电场和压力来调节多肽的洗脱。并且我们评价了亲水性相互作用、离子交换和电迁移对多肽分离的贡献，并讨论了保留机制。用梯度洗脱法分离eHPLC系统中的多肽，研究了压力、电场、有机溶剂、pH值、离子强度等因素对多肽混合物分离的影响。