基因中核酸熔解曲线分析检测方案(PCR)

Archimed Application Note-核酸熔解曲线 利用 Archimed 定量 PCR进行核酸熔解曲线分析 Welcome to Archimed Analyzer ROCGENE 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 核酸熔解曲线分析——是否存在非特异性扩增 熔解曲线是指随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度 (Tm， DNA 双链解链50%的温度)，不同长度及碱基组成的 DNA， Tm 值不同。DNA中G-C含量越高， Tm 值越高，成正比关系。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，熔解温度上有一特征峰，用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变与温度作图获得熔解曲线图谱。在定量 PCR 实验中，由于染料法的特异性较差，因此进行染料法实验时经常需要通过熔解曲线来考察扩增产物是否是目标产物。 核酸熔解曲线常用来： √ 区分特异性与非特异性产物(引物二聚体) √ 确定目标基因的Tm值 重要提示：分析 real time PCR 结果的特异性：出现单峰说明扩增产物特异性好，出现杂峰特异性差，存在非特异性扩增，如引物二聚体等。一般是用 SYBR Green 作为荧光染料的时候使用，因为 SYBR Green 染料是非特异的染料，只要有扩增，染料就可以嵌入双链中发出荧光。做熔解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我们需要的产物，如果熔解曲线做出来只有单峰，且出峰位置是退火温度，则是目标产物发出的荧光，实实结果有效。 利用Archimed 荧光定量 PCR 进行核酸熔解曲线实验的一般步骤 为了帮助实验人员更便捷地进行核酸熔解曲线研究， Archimed 定量 PCR 在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。利用 Archimed 软件智能设置向导，完成一个核酸熔解曲线实验只需简单的6个步骤： 1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择"创建”，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择熔解曲线 2.设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面 3. 设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性 注： Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。 4. 运行实验：运行条件或孔板设置完成后，点击页面左侧实验运行或或下角的下一步，进入仪器运行界面 5. 结果查看及分析：运行完成后， Archimed 软件将使用默分分析设置自动分析数据，结果分析界面中显示熔解曲线图谱。点击列表，软件将以列表形式展示实验结果，包括C样本名称、检测项目、Tm 等实验信息 上一步 下一步 6.导出结果：单击导出按钮，结果会显示在一个一开的 Excel中，表格中包含孔板设置、扩增数据、多组分数据、结果等 sheet；用于数据分析的Tm、数量(浓度)相关参数等信息会在结果表格中展示 应用实例分享——利用 Archimed 定量 PCR 核酸熔解曲线检验非特异性扩增 以下我们将以一个真实实验为例，展示利用 Archimed 定量 PCR核酸熔解曲线检验样本中是否存在引物二聚体。 材料和方法： 试剂和耗材： ● 样本： HELAFOXCL2-M8样本的 RNA， 3个技术重复。 引物： star-qpcr1 的引物 ● 反转录试剂： TAKARA ● QPCR试剂： TAKARA ● 8连排QPCR管 仪器： ● 品牌： Rocgene (鲲鹏基因) 型号： Archimed X6 实时荧光定量 PCR仪 反应体系： MIX 10uL ● 引物F 0.8uL 引物R 0.8uL ● 模板 2pL(反转录得到的 cDNA 稀释两倍作为模板) ● 水 6.4uL ● Total 20pL 反应程序： 实验结果 根据实验结果分析，熔解曲线图谱中得到2个峰，分别代表代表2个PCR产物的Tm值，说明产物中存在非特异性产物，即引物二聚体。 熔解曲线结果： 讨论 通过本实验的结果可以看出，该实验中存在引物二聚体，这可能是由于引物设计不合理、退火温度过高、模板和引物的用量比例不合适，所以建议重新设计引物，并适当降低退火温度，调整模板和引物用量，需排查原因，优化实验体系； 利用 Archimed 荧光定量 PCR 仪可以快速便捷地开展核刻熔解曲线研究， Archimed软件以图谱的形式直观的体现出样本中有几种熔解温度，进而判断该样本是否存在引物二聚体污染，极大提高了实验人员的工作效率。 关于 Archimed 荧光定量 PCR系统 Archimed 荧光定量 PCR 是因鹏基因为满足中高端用户的切实需求而匠心打造的全球首款时间分辨实时荧光定量 PCR 系统。基于菲涅尔透镜的新型光信号采集技术、专利的时间分辨信号分离技术及独特的控温技术，使Archimed 系列产品在检测灵敏度、多色串扰、温度均一性及准确性等方面达到国际先进水平。同时，基于全球视野的产品设计理念及制造工艺，赋予 Archimed 国际水准的优异品质。Archimed 将秉承中国智造、追求卓越的工匠精神，携手中国用户成就未来。 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 地址：北京市昌平区龙域北街10号创集合产业园429室电话：010-59724295 邮编：102208 网址： www.rogene.com Archimed荧光定量 PCR 系统 熔解曲线是指随温度升高 DNA 的双螺旋 结构降解程度的曲线。总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为 熔解温度Tm DNA双链解链50%的温度），不同长度及碱基组成的DNA Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm 值越高，成正比关系。 熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的 荧光信号来产生熔解曲线，熔解温度上有一 特征峰用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料 又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变与温度作图 获得熔解曲线图谱。在定量PCR实验中，由于染料法的特异性较差，因此进行染料法实验时经常 需要 通过 熔解 曲线 来 考察扩增产物是否是目标产物。    核酸熔解曲线常用来:    ✓ 区分特异性与非特异性产物（引物二聚体）    ✓ 确定目标基因的 Tm 值利用Archimed荧光定量PCR进行核酸熔解曲线实验的一般步骤：1. 创建实验： 点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择熔解曲线2. 设置反应条件： 实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面3. 设置孔板： 运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性4. 运行实验： 运行条件或孔板设置完成后，点击页面左侧实验运行或右下角的下一步，进入仪器运行界面5. 软件分析结果展示：