核酸中相对定量检测方案(PCR)

Archimed Application Note-基因表达相对定量(△▲CT) 利用 Archimed 定量 PCR进行基因表达相对定量(^^CT))分析 Welcome to Archimed Analyzer ROCGENE 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 基因表达的AACt法相对定量分析 相对定量适用于大多数基因表达研究，可分析校准(正常)样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。采用该方法无需精确测定拷贝数，而是关注目的基因的相对表达量的变化。△ACt 法是一种非常普遍的相对定量分析方法，该方法能够用于比较包括校准品(如未处理或野生型样本)和标准品(如看家基因表达)在内的实验样本的结果。采用该方法，可根据检测样本和校准样本中的标准品(正常)基因的 Ct 比较同样两个样本中的目的基因的Ct，其得出的△ACt值可用于测定表达的倍数差异。 相对定量实验常用来： √ 比较基因在不同组织中的表达水平。 √ 比较处理过的样品和未处理过的样品中基因的表达水平。 √ 比较不同遗传背景下感兴趣基因的表达水平。 √ 分析特定处理下基因随时间的表达变化。 重要提示： AACt方法要求看家基因和靶基因的扩增效率接近。那么，可接受的二者间扩增效率的偏差范围是多大呢?确定该范围的方法是生成相同样本中的看家基因和目的靶基因的标准曲线，获得每个稀释度的看家基因和靶基因的平均 ACt。此处，数值本身并不重要，重要的是各个稀释度的差值的一致性。一般以目标基因和看家基因扩增效率都接近 100%且相互间效率偏差在5%以内为可用标准，或者以目标基因和看家基因起始模板各稀释度的量与各稀释度的▲Ct作图，获取斜率，斜率<0.1一般被视为可接受的范围。 利用Archimed 荧光定量 PCR 进行AACt法相对定量分析的一般流程 为了帮助实验人员更便捷地进行基因表达相对定量研究， Archimed 定量 PCR 在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。利用 Archimed 软件智能设置向导，完成一个AACt 相对定量实验只需简单的6个步骤： 1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建"，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择相对定量(^^Ct) 2. 设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面 3. 设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性 注： Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。 4. 运行实验：运行条件或孔板设置完成后，点击页面左侧实验运行或或下角的下一步，进入仪器运行界面 5. 结果查看及分析：运行完成后， Archimed 软件将使用默认分析设置自动分析数据，结果分析界面中显示扩增图谱。若选择基因表达分析选项，则可直接查看基因表达相对定量分析结果，软件将以柱状图显示目标基因的表达差异及倍数关系，同时，软件将以列表形式展示实验结果，包括 CT、CT 平均值、CT SD、ACt、^^Ct等实验信息 6. 导出结果：单击导出按钮，结果会显示在一个打开的 Excel中，表格中包含孔板设置、扩增数据、多组分数据、结果等 sheet；用于数据分析的Ct值、数量(浓度)相关参数等信息会在结果表格中展示 应用实例分享——利用 Archimed 进行基因表达相对定量分析(^^Ct法) 以下我们将以一个真实实验为例，展示利用 Archimed 定量 PCR 进行基因表达相对定量分析的实验结果。该实验以 HELA 细胞系作为实验材料，将 FOXCL2-M8 和 FOXCL2-M10 质粒转入 HELA细胞系，目的是研究两种质粒对某信号通路上 IL2A、star-qpcr1 和IER3三个基因的表达影响，选用 GAPDH 作为内参基因。 材料和方法： 试剂和耗材： 样本： HELA，HELA FOXCL2-M8， HELA FOXCL2-M10三个样本的RNA， 每组3个技术重复。 引物： IL2A、star-qpcr1、IER3、GAPDH的引物 ● 反转录试剂： TAKARA QPCR试剂： TAKARA ● 96 孔QPCR板和96孔封口膜 仪器： ● 品牌： Rocgene (鲲鹏基因) ● 型号： Archimed X6 实时荧光定量 PCR仪 反应体系： ● MIX 10ul ● 引物F 0.8ul ● 引物R 0.8ul ● 模板 2ul (反转录得到的 cDNA 稀释两倍作为模板) ● 水 6.4ul Total 20ul 反应程序： 实验结果 根据实验结果分析，包括内参在内的四种基因， 在Archimed X6 上扩增重复性和特异性很好， CT 值的 SD均≤0.1；在HELA细胞系中转入两种质粒后， IER3 和IL2A两种基因的表达均有下降， star-qpcr1 基因的表达有上调。 扩增曲线结果： HELA GAPDH 12.7480.031 熔解曲线结果： MAMBMCEDLEMFMG■H 基因表达差异结果： 进行 RNA表达水平的相对定量实验，实验结果往往受到样品质量及实验操作的极大影响。通过本实验的多项结果可以看出，该实验中样品制备情况较况， RNA 提取效率及反转录效率均较高，且实验操作水平较高，因此实验结果未出现难以解释的扩增曲线类型： 利用 Archimed 荧光定量 PCR仪可以快速便捷地开展基因表达的相对定量研究，其中对于不同基因的表达差异分析， Archimed软件可以根据预先设置的孔板属性，通过内置的^^Ct算法，自动计算出目标基因的表达差异倍数关系，并以柱状图的形式直观展示基因表达结果，无需使用者导出 Ct 值等实验数据后，再手动进行计算分析及图表绘制，极大提高了实验人员的工作效率； 在实验样本及实验操作无较大隐患的基础上， Archimed 荧光定量 PCR 仪具有极佳的实验结果重复性及特异性，确保实验人员不存在对于实验设备的后顾之忧。 关于 Archimed 荧光定量 PCR 系统 Archimed 荧光定量 PCR 是因鹏基因为满足中高端用户的切实需求而匠心打造的全球首款时间分辨实时荧光定量 PCR 系统。基于菲涅尔透镜的新型光信号采集技术、专利的时间分辨信号分离技术及独特的控温技术，使Archimed 系列产品在检测灵敏度、多色串扰、温度均一性及准确性等方面达到国际先进水平。同时，基于全球视野的产品设计理念及制造工艺，赋予 Archimed 国际水准的优异品质。Archimed 将秉承中国智造、追求卓越的工匠精神，携手中国用户成就未来。 鲲鹏基因(北京)科技有限责任公司 地址：北京市昌平区龙域北街10号创集合产业园429室电话：010-59724295 邮编：102208 网址： www.rogene.com Archimed荧光定量PCR 系统     基因表达的ΔΔCt法相对定量分析相对定量适用于大多数基因表达研究，可分析校准正常 样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。采用该方法无需精确测定拷贝数，而是关注 目的基因的相对表达量 的变化。ΔΔCt法是一种非常普遍的相对定量分析方法， 该方法能够用于 比较包括校准品 如未处理或野生型样本)和标准品如看家基因表达 ) 在内的实验样本的结果。采用该方法，可根据检测样本和校准样本中的标准品正常) 基因的Ct比较同样两个样本中的目的基因的Ct其得出的ΔΔCt值可用于测定表达的倍数差异。        相对定量实验常用来:        ✓ 比较基因在不同组织中的表达水平。        ✓ 比较处理过的样品和未处理过的样品中基因的表达水平。        ✓ 比较不同遗传背景下感兴趣基因的表达水平。        ✓ 分析特定处理下基因随时间的 表达变化 。重要提示：ΔΔCt方法要求 看家基因 和靶基因的 扩增 效率 接近 。 那么，可接受的二者间扩增效率的偏差范围是多大呢？ 确定该范围的方法是 生成 相同 样本 中的看家 基因和目的靶基因的标准曲线 获得每个稀释度的 看家基因 和靶基因的平均 ΔCt 。 此处， 数值本身并不重要重要的是各个稀释度的 差 值的一致性。 一般以目标基因和看家基因扩增效率都接近 100%且相互间效率偏差在5%以内为可用标准，或者以目标基因和看家基因起始模板各稀释度的量与各稀释度的ΔCt作图，获取斜率，斜率 <0.1一般被视为可接受的范围。    利用Archimed荧光定量PCR进行ΔΔCt法相对定量分析的一般流程： 孔板设置：结果分析：