抗疲劳饮料和补肾药酒中90种那非类物质检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-006Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-391 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai LCMS-8050定量测定抗疲劳饮料和补肾药酒中90种那非类物质 LCMSMS-391 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定抗疲劳饮料 和补肾药酒中90种那非类物质的方法。采用外标法定量，方法线性范围为 0.1~50.0 ng/mL， 相关系数大于0.998。保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.34%和1.22~4.96%之间。进样5.0uL， 检出限在0.0007~0.1379ng/mL之间，定量限在 0.0021~0.4221 ng/mL 之间。抗疲劳饮料样品有89种化合物加标回收率在81.6~113.5%之间。药酒样品有82种化合物加标勿收率在80.2~111.9%之间，有4种化合物加标回收率在 70.6~79.9%之间。使用本方法检测了三个品牌的抗疲劳饮料，其中斗个品牌检出西地那非 (Sildenafil)。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱那非类物质保健食品 那非类物质 (Antifatigue drugs) 是一种人体内5型磷酸二酯酶(PDE5)的抑制剂，可用于治疗男性勃起功能障碍。该类物质已知的副作用包括面部潮红、头晕、头痛、鼻塞和视觉异常等，严重的会导致死亡，是一种须在医生指导下服用的处方药。 近年来，随着化学合成技术的进步，一些具有PDE5 抑制活性的那非类衍生物不断涌现，被一些不法分子添加至标示或暗示具有补肾壮阳、抗疲劳、改善免疫力等作用的食品中，对服用者的健康和生命安全造成严重威胁。我国《食品安全法》第三十八条规定，生产经营的食品中不得添加药品，但是可以添加按照传统既 是食品又是中药材的物质。那非类物质是处方药，在食品或保健食品等特殊食品中添加属于违法行为，必须予以打击。 这些那非类物质结构类似，存在多种同分异构体，给质谱检测带来挑战。故需要充分优化色谱方法，有效分离同分异构体，从而实现准确定量。 本文参考国家市场监督管理总局于2018年7月2日发布的《食品中那非类物质的测定》的食品补充检验方法，采用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050，建立了食品中90种那非类物质的分析方法。供相关检测人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC自动进样器， CTO-20A 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050三重四匹杆质谱仪，LabSolutions (Version 5.93) 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件流速： 0.3 mL/min色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mml.D.×柱温：40℃150 mm L.， 2.0 um进样体积：5uL流动相：A相-0.1%甲酸；B相-甲醇洗针液：甲醇/水=1：1(v：v)洗针模式：进样前后洗针， External only (进样洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为15%，时针外壁清洗)， Rinse Port间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 泵 B.Conc 50 16.00 泵 B.Conc 65 19.00 泵 B.Conc 98 22.00 泵 B.Conc 98 22.10 泵 B.Conc 15 25.00 控制器 Stop 质谱条件 离子化模式：ESI，正负离子同时检测 干燥气流速：10.0 L/min 碰撞气：氩气270 kPa 雾化气流速： 3.0L/min 接口温度：300C扫描模式：多反应监测(MRM) 加热模块温度：400℃ DL 温度：250℃ 加热气流速：10.0L/min MRM参数：见表2 表2 MRM参数 No. 英文名称 中文名称 CAS号 参考保留时间 (min) 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 Sildenafil 西地那非 139755-83-2 5.386 475.20 100.20* 283.20 -11 -11 -28 -39 -18 -19 2 Tadalafil 他达拉非 171596-29-5 9.395 390.10 135.00* 204.05 -30 -30 -23 -55 -14 -30 3 Imidazosagatriazinone 脱硫伐地那非 139756-21-1 19.110 313.15 285.10* 256.10 -11 -11 -25 -29 -30 -28 4 Gendenafil 庆地那非 147676-66-2 14.338 355.20 285.20* 327.20 -10 -10 -30 -25 -19 -16 5 Acetil acid 那非乙酰酸 147676-78-6 12.474 357.20 329.20* 285.20 -10 -10 -26 -30 -16 -20 6 Xanthoanthrafil 苯酰胺那非 1020251-53-9 7.596 390.20 151.10* 107.10 -11 -11 -20 -58 -16 -19 7 Aminotadalafil 氨基他达拉非 385769-84-6 7.569 391.10 204.10* 262.10 -14 -20 -60 -32 -21 -30 8 Chloropretadalafil 他达拉非甲基氯化物 171489-59-1 12.499 427.15 135.10* 274.10 -10 -12 -21 -33 -14 -30 9 Piperiacetildenafil 苯噻啶红地那非 147676-50-4 5.061 438.25 98.15* 297.20 -10 -10 -32 -37 -18 -20 10 Noracetildenafil 那红地那非 949091-38-7 4.814 453.25 97.10* 113.15 -10 -13 -31 -31 -18 -20 11 Carbodenafil 卡巴地那非 944241-52-5 4.221 453.30 339.20* 311.20 -10 -10 -24 -33 -17 -15 12 Pseudovardenafil 伪伐地那非 224788-34-5 16.629 460.2 151.15* 312.25 -13 -11 -42 -37 -16 -22 13 Norneosildenafil 那莫西地那非 371959-09-0 18.768 460.2 283.10* 299.20 -13 -13 -36 -37 -19 -21 14 N-Desethylvardenafil N-去乙基伐地那非 448184-46-1 4.976 461.20 151.10* 312.25 -13 -11 -43 -37 -15 -22 15 N-Desmethylsildenafil N-去甲基西地那非 139755-82-1 5.308 461.20 283.10* 311.20 -13 -13 -38 -29 -19 -15 16 Acetildenafil 红地那非 831217-01-7 4.956 467.30 111.20* 127.20 -11 -13 -31 -31 -21 -13 17 Hydroxyacetildenafil 羟基红地那非 147676-56-0 4.755 483.25 127.15* 143.15 -11 -11 -30 -33 -23 -27 18 375.20* -11 -26 -18 LCMSMS-391 20 Homosildenafil 豪莫西地那非 642928-07-2 5.325 489.20 72.10* 113.15 -11 -11 -48 -29 -18 -26 21 Vardenafil 伐地那非 224785-90-4 5.009 489.20 151.10* 312.20 -11 -14 -47 -40 -15 -22 22 Thiosildenafil 硫代西地那非 479073-79-5 10.631 491.15 299.05* 100.20 -30 -30 -38 -30 -15 -20 23 Thiohomosildenafil 硫代豪莫西地那非 479073-80-8 10.760 505.25 113.20* 299.10 -24 -24 -31 -39 -21 -20 24 Hydroxyvardenafil 羟基伐地那非 224785-98-2 4.973 505.20 151.10* 312.20 -20 -20 -49 -39 -15 -15 25 Hydroxyhomosildenafil 羟基豪莫西地那非 139755-85-4 5.269 505.25 99.20* 129.20 -20 -24 -39 -29 -19 -24 26 Udenafil 乌地那非 268203-93-6 6.261 517.25 283.15* 112.15 -20 -20 -45 -34 -19 -21 27 Hydroxythiohomosildenafil 羟基硫代豪莫西地那非479073-82-0 10.682 521.25 99.20* 129.20 -20 -24 -40 -31 -18 -13 28 Norneovardenafil 那莫伐地那非 358390-39-3 10.395 357.15 151.10* 329.20 -10 -10 -30 -24 -16 -16 29 Nitrodenafil 硝地那非 147676-99-1 17.791 358.20 284.20* 330.20 -10 -10 -31 -23 -19 -23 30 Nortadalafil 去甲基他达拉非 171596-36-4 8.091 376.10 204.10* 262.10 -30 -30 -56 -29 -21 -28 31 Chlorodenafil 氯地那非 1058653-74-9 15.832 389.10 361.20* 285.10 -11 -11 -27 -33 -18 -20 32 Hydroxychlorodenafil 羟基氯地那非 1391054-00-4 14.566 391.20 313.20* 285.20 -11 -11 -34 -32 -22 -20 33 N-Butyltadalafil N-丁基他达拉非 171596-31-9 16.426 432.20 310.20* 135.10 -10 -10 -17 -24 -15 -14 34 Desmethylcarbodenafil 去甲基卡巴地那非 147676-79-7 4.138 439.20 339.20* 311.20 -10 -10 -23 -33 -17 -15 35 Descarbonsildenafil 去碳西地那非 1393816-99-3 4.794 463.20 283.20* 311.20 -11 -11 -39 -31 -19 -22 36 Dimethylacetildenafil 二甲基红地那非 1290041-88-1 5.667 467.25 127.20* 166.10 -11 -11 -31 -53 -17 -13 471.25 371.20* -13 -24 -18 37 Dithio-desmethylcarbodenafil 二硫代去甲基卡巴地那非1333233-46-7 11.548 343.20 -11 -35 -24 38 Oxohongdenafil 酮红地那非 1446144-70-2 410.25* -11 -31 -20 LCMSMS-391 50 2-Hydroxypropylnortadalafil 2-羟丙基去甲他达拉非1353020-85-5 9.682 434.20 135.10 312.20* -12 -10 -22 -16 -14 -22 51 Acetylvardenafil 乙酰伐地那非 1261351-28-3 4.410 467.30 135.10 151.10* -12 -13 -24 -46 -24 -15 111.20 -10 -31 -20 52 Propoxyphenyl hydroxyhomosildenafil 丙氧苯基羟基 豪莫西地那非 139755-87-6 6.443 519.20 99.20* 283.10 -20 -20 -40 -38 -18 -19 53 Propoxyphenyl thioaildenafil 丙氧苯基硫代艾地那非85619049-3 13.879 519.20 299.00* -12 -37 -21 112.95 -30 -33 -30 54 Yohimbine 育亨宾 146-48-5 3.179 355.20 144.10* 212.10 -10 -10 -30 -24 -15 -22 55 Dapoxetine 达泊西汀 119356-77-3 6.792 306.15 157.10* 127.10 -11 -11 -25 -50 -16 -22 56 N-Desethylacetildenafil N-去乙基红地那非 147676-55-9 4.848 439.20 99.20* 166.10 -10 -10 -30 -49 -19 -17 57 Desmethylthiosildenafil 去甲基硫代西地那非 479073-86-4 10.698 477.20 299.20* 327.20 -11 -11 -37 -29 -21 -16 58 N-Boc-N-desethyl acetildenafil N-叔丁氧羰基-N-去 乙基红地那非 1246820-46-1 9.413 539.30 439.20* 99.20 -20 -20 -21 -37 -22 -18 59 N-Ethyltadalafil N-乙基他达拉非 1609405-34-6 10.919 404.20 135.10* 282.20 -11 -11 -21 -16 -25 -19 60 O-Desethylsildenafil O-去乙基西地那非 139755-91-2 6.559 447.20 283.10* 299.20 -10 -10 -28 -31 -19 -21 61 Pyrazole N-desmethylsildenafil 吡唑N-去甲基西地那非139755-95-6 3.792 461.20 100.20* 269.10 -10 -10 -28 -38 -19 -18 62 Isobutylsildenafil 异丁基西地那非 1391053-95-4 6.409 489.20 100.20* 297.20 -11 -11 -29 -39 -19 -20 283.20* 63 Sildenafil dimer impurity 西地那非二聚体杂质 1346602-67-2 19.850 835.30 299.10 -20 -20 -60 -53 -19 -21 64 Vardenafil oxopiperazine 伐地那非哌嗪酮 448184-58-5 7.932 475.15 151.10* 312.20 -11 -11 -52 -36 -15 -22 65 Sildenafil N-oxide 西地那非N-氧化物 1094598-75-0 5.732 491.20 404.20* 99.20 -11 -20 -29 -23 -20 -24 66 Vardenafil N-oxide 伐地那非N-氧化物 448184-48-3 5.370 505.20 477.25* 151.10 -20 -24 -23 -62 -24 -15 67 2-Hydroxyethylnortadalafil 2-羟乙基去甲他达拉非385769-94-8 8.487 420.15 298.20* 169.10 -12 -12 -16 -38 -21 -17 LCMSMS-391 379.10* -11 -27 -19 79 Dichlorodenafil 双氯地那非 1446089-84-420.694 407.10 350.10 -11 -32 -17 80 Piperazonifil 哌唑那非 1335201-04-1 5.667 483.20 436.30* 166.10 -11 -11 -30 -53 -22 -17 81 Propoxyphenyl thiosildenafil 丙氧苯基硫代西地那非479073-87-5 12.912 505.20 299.15* 313.20 -14 -30 -38 -33 -21 -30 82 Propoxyphenyl thiohomosildenafil 丙氧苯基硫代 豪莫西地那非 479073-88-6 13.019 519.20 299.10* 113.20 -20 -20 -39 -31 -20 -20 83 Dithiodesethyl carbodenafil 二硫代去乙基卡 巴地那非 1610830-81-3 11.345 457.20 371.20* 343.10 -10 -10 -23 -34 -18 -24 84 Hydroxythioacetildenafil 羟基硫代红地那非 1159977-47-5 9.773 499.20 127.20* 143.20 -11 -11 -31 -32 -13 -15 85 Tadalafil dichloro impurity 他达拉非二氯代杂质 1598416-08-0 15.251 461.00 134.95* 204.10 -30 -30 -21 -68 -14 -22 86 Sildenafil impurity 12 西地那非杂质12 12.538 499.20 343.15* 371.15 -11 -30 -38 -27 -24 -30 87 Demethylpiperaziny sildenafil sulfonic acid 去甲基哌嗪基 西地那非磺酸 1357931-55-5 5.410 393.10 365.20* 256.10 -11 -11 -27 -34 -26 -28 88 Propoxyphenyl aildenafil 丙氧苯基艾地那非 1391053-82-9 7.014 503.20 283.10* 113.25 -24 -24 -38 -31 -19 -22 89 Sildenafil impurity 14 西地那非杂质14 2146091-79-2 12.741 485.20 343.10* 371.20 -11 -11 -36 -25 -24 -18 90 Propoxyphenylisobutyl aildenafil 丙氧苯基异丁基 艾地那非 1621873-33-3 8.503 517.30 297.35* 113.20 -20 -20 -38 -32 -20 -22 *代表定量离子对。 1.3标准溶液配制 取90种那非类化合物混合标准贮备液(5mg/L)，以纯甲醇逐级稀释为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL 的九个不同浓度的混合标准工作溶液。 1.4样品前处理 取试样(饮料、酒)适量摇匀，准确吸取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取 15 min， 放冷至室温，用甲醇定容，经有机相微孔滤膜过滤，取滤液待测。 建议实验全过程采用塑料容器，以避免少数那非类化合物对于玻璃器皿的吸附。 结果与讨论 2.1 混合标准样品色谱图 图1.90种那非类化合物标准品色谱图(1.0ng/mL) 2.2线性关系 按照1.3配制九个不同浓度的混合标准工作溶液，按照1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法绘制标准曲线。各化合物线性方程、线性范围、相关系数、检出限(S/N=3，软件计算)和定量限(S/N=10， 软件计算)结果见表3。90种那非类化合物校准曲线在 0.1~50 ng/mL浓度范围内，相关系数大于0.998，线性良好。检出限在0.0007~0.1379 ng/mL 之间，定量限在 0.0021~0.4221 ng/mL 之间，灵敏度高。 表3线性关系、检出限和定量限(权重1/C) LCMSMS-391 Vardenafil N-oxide Y=(243660)X+(1336.92) 0.1-50 86.3-106.3 0.9991 0.0070 0.0212 2-Hydroxyethylnor tadalafil Y=(31792.0)X+(-457.678) 0.2-50 91.0-111.4 0.9996 0.0298 0.0903 Vardenafil acetyl analogue Y=(268684)X+(-111.528) 0.1-20 87.5-108.2 0.9993 0.0020 0.0059 Vardenafil dimer (+) Y=(45497.8)X+(-1506.98) 0.1-50 89.6-107.5 0.9992 0.0264 0.0800 Vardenafil dimer (-) Y=(53305.5)X+(-483.201) 0.1-50 92.0-110.6 0.9999 0.0072 0.0219 Mirodenafil Y=(57104.2)X+(-1120.21) 0.1-50 91.1-108.0 0.9996 0.0071 0.0216 Mutaprodenafil Y=(88084.3)X+(-614.563) 0.1-50 90.7-108.8 0.9990 0.0121 0.0366 Thioquinapiperfil Y=(1.89825e+006)X+(-68472.7) 0.1-50 91.8-106.9 0.9989 0.0041 0.0125 Aminosildenafil Y=(104905)X+(-2121.30) 0.1-50 92.8-104.7 0.9998 0.0140 0.0425 Desethylcarbodenafil Y=(178444)X+(-805.307) 0.1-50 88.0-112.6 0.9997 0.0055 0.0166 Didescarbonsildenafil Y=(97259.6)X+(-2467.70) 0.1-50 89.1-108.6 0.9996 0.0080 0.0244 N-Phenylpropenyl tadalafil (+) Y=(11703.5)X+(-287.958) 0.5-50 87.5-107.5 0.9997 0.1393 0.4221 N-Phenylpropenyl tadalafil (-) Y=(4847.98)X+(57.8305) 0.5-50 88.6-108.6 0.9995 0.1379 0.4180 N-Desethyl-N-methylvar denafil Y=(118175)X+(244.781) 0.1-20 87.2-111.5 0.9994 0.0049 0.0149 Thioaildenafil Y=(69533.2)X+(3367.93) 0.2-50 89.2-111.7 0.9997 0.0389 0.1178 Dichlorodenafil Y=(314294)X+(10414.1) 0.1-50 85.5-106.6 0.9997 0.0069 0.0209 Piperazonifil Y=(50539.4)X+(-712.163) 0.2-50 86.6-109.6 0.9994 0.0422 0.1278 Propoxyphenyl thiosildenafil Y=(81550.7)X+(-12405.6) 0.5-50 90.1-108.4 0.9997 0.0221 0.0669 Propoxyphenyl thiohomosildenafil Y=(98169.5)X+(-8631.39) 0.2-50 87.7-113.6 0.9998 0.0605 0.1834 Dithiodesethyl carbodenafil Y=(349865)X+(-89360.1) 0.5-50 90.6-115.9 0.9996 0.0255 0.0774 Hydroxythioacetildenafil Y=(89554.1)X+(-6779.36) 0.2-50 91.8-107.3 0.9994 0.0161 0.0487 Tadalafil dichloro impurity Y=(41168.4)X+(-2174.28) 0.2-50 88.9-115.4 0.9998 0.0287 0.0871 Sildenafil impurity 12 Y=(570727)X+(-112257) 0.5-50 91.9-112.4 0.9997 0.0099 0.0301 Demethylpiperaziny sildenafil sulfonic acid Y=(18105.8)X+(-2088.66) 0.5-50 88.7-110.8 0.9998 0.0611 0.1850 Propoxyphenyl aildenafil Y=(116590)X+(-48.6511) 0.1-50 89.1-111.9 0.9995 0.0179 0.0544 Sildenafil impurity 14 Y=(813346)X+(-167325) 0.5-50 90.2-114.6 0.9997 0.0020 0.0060 Propoxyphenylisobutyl aildenafil Y=(79158.4)X+(-1467.57) 0.1-50 90.3-109.8 0.9996 0.0046 0.0140 对 2 ng/mL 的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.02~0.34%和1.22~4.96%之间，仪器精密度良好。 4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) RSD% No. 1 2 3 4 5678 9巧34 Propoxyphenylsildenafil 2.4加标回收实验 取1mL样品，加入那非类化合物混合标准溶液，配制成浓度为100 ng/mL的加标样品，按照1.4中的方法进行前处理，上机分析。抗疲劳饮料样品色谱图和补肾药酒样品品谱图见图2~图3.加标回收结果见表5。该抗疲劳样品中检出 Sildenafil， 浓度为 38.85 ng/mL。抗疲劳饮料样品有89种化合物加标回收率在81.6~113.5%之间。药酒样品有82种化合物加标回收率在 80.2~111.9%之间，有4种化合物加标回收率在70.6~79.9%之间。 c切 10.0 12.5图2抗疲劳饮料样品 (x1，000) 2.50 图3补肾药酒样品 图4抗疲劳饮料和补肾药酒回收率统计 表5样品加标回收率(加标浓度100 ng/mL) 抗疲劳饮料 补肾药酒 2.5实际样品分析 使用本方法分析了三种品牌的抗疲劳饮料，每个样品平行分析两次，品牌1和品牌2检出西地那非，未检出其他化合物。品牌3未检出任何化合物。西地那非定量结果见表6。 表6样品分析结果 样品名称 分析结果 品牌1 西地那非 (Sildenafil) ) ，38.85ng/mL，51.15 ng/mL 品牌2 西地那非 (Sildenafil) ， 品牌3 未检出 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定抗疲劳饮料和补肾药酒中90种那非类化合物的方法。本方法基于国家市场监督管理总局发布的标准，可在25 min 内正负离子同时检测90种那非类化合物。方法线性范围宽、重复性好、准确度高，优于食品补充检验方法标准要求。使用本方法测定了三个品牌的抗疲劳饮料样品，其中两个品牌检出西地那非 (Sildenafil)。补肾药酒中未检出90种那非类化合物。本方法简单、快速、灵敏、准确，可用于食品中90种那非类物质的定量检测和定性筛查。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定抗疲劳饮料和补肾药酒中90种那非类物质的方法。采用外标法定量，方法线性范围为0.1~50.0 ng/mL，相关系数大于0.998。保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.34%和1.22~4.96%之间。进样5.0 µL，检出限在0.0007~0.1379 ng/mL之间，定量限在0.0021~0.4221 ng/mL之间。抗疲劳饮料样品有89种化合物加标回收率在81.6~113.5%之间。药酒样品有82种化合物加标回收率在80.2~111.9%之间，有4种化合物加标回收率在70.6~79.9%之间。使用本方法检测了三个品牌的抗疲劳饮料，其中两个品牌检出西地那非（Sildenafil）。