岛津Nexera Mikros微流量在线捕集系统检测乳糖辅料中微量α-乳白蛋白

SSL-CA14-984Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-388 Nexera Mikros微流量在线捕集系统检测乳糖辅料中微量α-乳白蛋白 LCMSMS-388 摘要：本实验使用岛津微流量系统 Nexera Mikros 建立了乳糖辅料中a-乳白蛋白(a-La， a-Lactalbumin) 的定量分析方法，考察了 Nexera Mikros 直接进样系统与岛津超高效液相色谱 LC-30A 结合 LCMS-8060三重四极杆质谱联用仪在 α-乳白蛋白的灵敏度差异。2 uL进样体积下， 50 nmol/L a-乳白蛋白标准溶液， Mikros 比 LC-30A 灵敏度提升了约7.4倍。使用 Nexera Mikros 在线捕集洗脱系统，乳糖在Trap 柱上不保留，仅对乳清蛋白的特征肽段在线富集并检测，避免高浓度乳糖堵塞微流量系统。实验结果表明： Nexera Mikros 在线捕集系统情况下，以 10 uL体积为进样量，捕集效率约为32%。α-乳白蛋白特异肽段在5~200 nmol/L浓度范围内的标准曲线相关系数良好(R=0.9965)，标线各点的准确度范围在94.0~115.9%；5和50 nmol/L 浓度的标准溶液平行测定6次，保留时间的 RSD 不大于0.06%，峰面积 RSD 不大于 9.92%。多份实际样品均检出a-乳白蛋白。 乳糖做为药用辅料的历史已经超过了一个世纪，广泛用于口服胶囊剂和片剂的稀释剂。药用乳糖辅料的生产工艺是以牛乳清为原料。牛乳清是牛奶经提炼出奶酪和酪蛋白后的残留液体。因此乳糖辅料的生成过程中难以避免会残留微量的牛奶过敏原，如乳清蛋白、乳白蛋白等，其含量极低，用常规 LCMS 难以检测。 岛津 Nexera Mikros 微流量液质联用系统，可对应从微量流速(1uL/min~100 pL/min)到半微量流速(100pL/min~500uL/min) 的宽流速范围。相比半微量液相 色谱， Nexera Mikros 在与 LCMS联用检测目标化合物时可以获得更高的灵敏度；与纳升 LCMS系统相比，可以获得更短的分析时间和更好的稳定性。 岛津微流量液质联用系统 Nexera Mikros， 采用了新型微流量送液泵及样品导入质谱时的角度、位置均优化过的离子化接口，减少样品基质效应及质谱污染，实现较高的分析灵敏度。利用捕集洗脱系统的富集除杂功能，结合 Mikros 高灵敏度特性，实现乳糖辅料中微量a-乳白蛋白检测。 1.1 Nexera Mikros 在线捕集浓缩系统 仪器：岛津微流量液相色谱仪 Nexera Mikros 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用在线捕集浓缩系统。具体配置为： LC-30AD×2(捕集流路)， LC-Mikros 输液泵(分析流路)， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC自动进样器(15pL定量环)， CTO-40M 柱温箱， CBM-20A系统控制器， Option Box VP，FCV-32AH， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪配 Micro-ESI 8060 离子源， LabSolutions Ver. 5.93 色谱工作站。 图1 Nexera Mikros捕集洗脱系统示意图 1.2分析条件 液相色谱条件： 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液； B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：5.0uL/min 捕集流动相：C-水；D-乙腈 捕集流速：40pL/min 柱温：40C 进样量：10uL 自动进样器温度：10℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.00 Option Box vp Valve A Position 1 2.10 泵 Pump A B.Conc 10 3.10 泵 B.Flow 0.04 3.10 泵 C.Flow 0 3.20 泵 B.Flow 0 3.20 泵 C.Flow 0.04 4.20 泵 Pump A B.Conc 24 4.30 泵 Pump A B.Conc 100 8.00 泵 B.Flow 0 8.00 泵 C.Flow 0.04 8.00 泵 Valve A Position 0 8.10 泵 B.Flow 0.04 8.10 泵 C.Flow 0 10.00 泵 Pump A B.Conc 100 10.10 泵 Pump A B.Conc 10 17.00 控制器 Stop 质谱条件： 离子源： ESI(+) 雾化气流速：1.5L/min 加热气流速：OFF 接口温度： OFF 接口电压：2kV加热模块温度：400℃扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气流速：OFF DL温度：250℃ MRM参数：见表2 表2 MRM优化参数 选择的肽段 前体离子(m/z) 产物离子(m/z) Q1 Pre Bias (V) ) CCE (V) Q3 Pre Bias (V) a-乳白蛋白 600.95 284.10* -22.0 -31.0 -21.0 特异肽段 355.20 -22.0 -29.0 -17.0 注：*表示定量离子 1.3 LC-30A+LCMS-8060 仪器： 岛津超高效液相色谱 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为： LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5R在线脱兑机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-Mikros 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.93 色谱工作站。 分析条件(参考岛津应用文集LCMSMS-196) 液相色谱条件： ×100 mmL.，1.9um) 进样量：2uL 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液； 自动进样器温度：10℃ B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.4mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表3. 表3梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.80 B.Conc 5 1.20 B.Conc 2.50 B.Conc 2.60 B.Conc 4.20 B.Conc 4.30 B.Conc 100 5.00 B.Conc 100 5.10 B.Conc 5 8.00 控制器 Stop 质谱条件 (LC-30A+LCMS-8060)) ： 离子源： ESI(+) 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0L/min 接口温度：300℃ 雾化气流速： 3.0L/min 驻留邵间：47ms 加热模块温度：400C DL温度：250℃ 加热气流速：10.0 L/min 接口电压： +4.5kV 1.4标准品与试剂 牛α-乳白蛋白特异肽段标准品(序列： VGINYWLAHK， 分子量1200.4 Da，纯度≥99%)；乙乙购自Merck 公司；实验用水由 Milli-Q Plus 水净化系统 (Millipore， Ltd.) 经去离子与二次净化制得；甲酸(纯度99%， Wako，Japan)；其余试剂均为分析纯；碱性胰蛋白酶：活力大于10000 BAEE 每毫克蛋白质。 碳酸氢铵溶液(500 mmol/L)：称取碳酸氢铵3.95 g， 用水溶解后定容至100 ml；二硫苏糖醇溶液(500 mmol/L)：二硫苏糖醇0.771g用碳酸氢铵溶液定容至10mL； 碘代乙酰胺溶液(500mmol/L)：碘代乙酰胺 0.925g碳酸氢铵溶液定容至10mL； 氯化钙溶液(100mmol/L)：称取氯化钙0.111g，用水溶解后定容至10mL； 乙酸溶液(1%，V/V)：移取乙酸0.1mL， 用水稀释并定容至10 mL； 胰蛋白酶溶液 (500 ug/mL)：称取胰蛋白酶5mg，用乙酸溶液溶解后定容至10mL。 1.5对照品溶液及内标溶液的配制 牛a-乳白蛋白特异肽段标准储备溶液(500 umol/L)：准确称取牛α-乳白蛋白特异肽段固体6.00 mg (准确至0.01mg)，用水溶解并定容至10mL， 混匀。将配制的溶液转移到塑料瓶中，置于冰箱内冷冻保存。 标准系列工作溶液：分别吸取特异肽段标准中间混合溶液，用0.1%甲酸水溶液稀释，得a-乳白蛋白特异肽段浓度为5、10、25、50、200 nmol/L 的标准系列工作溶液。临用前配制。 1.6样品制备 精确称取乳糖试样约 0.2g于2mL离心管中，溶解后用水定容至1mL， 离心取上清液，备用。准确移取200uL试样溶液，于2mL离心管中，加入10 uL 二硫苏糖醇溶液，混匀，置于50℃下恒温反应 30 min；冷却至室温，加入30 uL碘代乙酰胺溶液，暗处静置30 min；完成后加入630 uL碳酸氢铵溶液和 10 uL 氯化钙溶液和50 uL 胰蛋白酶海液，混匀，置于37℃下恒温酶解5小时及以上。加入20 uL甲酸，混匀，室温下静置 15 min， 混匀，用0.22um 滤膜过滤，供液相色谱串联质谱仪检测。 结果与讨论 2.1灵敏度比较 为了客观的比较 Mikros 系统与常规液相的灵敏度，两个系统均采用直接进样方式，噪音计算方法选择 ASTM 法，噪音选择范围设置为各峰前后3区，间隔0.5 min。2uL进样体积体，5nmol/La-乳白蛋白标准溶液Mikros信噪比6.9，常规 LCMS未检出；50 nmol/La-乳白蛋白标准溶液 Mikros 信噪比79.7，常规LCMS 信噪比 10.7， Mikros 比常规液相灵敏度提升了约7.4倍。 图2 NexeraMikros与LC-30A系统谱图对比 2.2捕集效率考察 由于实际样品中含有200g/L乳糖，直接进样易堵塞系统。本实验使用捕集洗脱系统进行检测。样品中残留的乳糖在 Trap 柱上不保留，仅对α-乳白蛋白的特征肽段在线富集并浓缩。捕集系统的进样体积为10 uL，25 nmol/L a-乳白蛋白标准溶液 Mikros 直接进样和 Mikros 捕集洗脱系统色谱图见图3。样品经捕集系统浓缩，信噪比提升2.4倍，峰高提升约1.5倍。考虑到进样体积的差异，用峰面积之比折算出捕集效率约为32%。 图3 Mikros 直接和捕集洗脱系统对比色谱图 2.3线性范围 采用 Mikros 捕集洗脱系统建立α-乳白蛋白工作曲线，按1.1中的分析条件进行分析检测，5、10、25、50、200 nmol/L外标法制作校准曲线，各级别线性回归的准确度、信噪比、定量限如表4所示。线性良好，线性方程、相关系数见图 4。 表4 a-乳白蛋白校准曲线准确度和定量限 口◇定定结果视图ID#2 ：乳白蛋白 Data# 数据文件名 浓度 (nmol) 标准浓度 精确度% 高度 S/H 定量限 1 mikros-trap-2 min 上样_a 5nmol b 4.714 5 94.3 5，087 10.51 4.49 2 mikros-trap-2 min 上样_a 10mmol 9.403 10 94.0 11，355 37.25 2.52 3 mikros-trap-2 min 上样_a 25nmol 28.975 25 115.9 37，017 84.23 3.44 4 mikros-trap-2 min 上样_a 50mmol 48.217 50 96.4 62，955 72.26 6.67 5 mikros-trap-2 min 上样_a 200mmol 198.690 200 99.3 275，886 390.78 5.08 图4 α-乳白蛋白的线性方程及相关系数 2.4 重复性考察 5 nmol/L 和50 nmol/L 标准溶液连续进样分析6次，计算保留时间及峰面积的相对标准偏差 (%RSD)。结果如表5所示，a-乳白蛋白特异肽段的保留时间及峰面峰 RSD 均处于合理范围。 表5重复性考察结果(n=6) 化合物 保留时间RSD (%) 峰面积RSD(%) 5nmol 50nmol 5nmol 50 nmol a-乳白蛋白 0.06 0.05 6.64 9.92 2.5实际样品检测 多份乳糖辅料样品，按照1.5所述步骤提取，1.1中的分析条件进行分析检测。所有样品中均检出a-乳白蛋白特异肽段。实际样品的典型色谱图见图5，检测结果见表6. 图5实际样品检测典型谱图 表6乳糖辅料实际样品检测结果 样品编号 含量(mg/kg) 样品编号 含量(mg/kg) 1-1 52.59 4-2 24.86 1-2 49.01 5-1 24.77 2-1 43.13 5-2 26.19 2-2 43.86 6-1 27.74 3-1 43.59 6-2 32.36 3-2 37.23 7-1 37.83 4-1 33.26 7-2 47.81 结论 本实验使用岛津微流量捕集洗脱系统建立了乳糖辅料中a-乳白蛋白的定量分析方法，10 uL进样量下， a-乳白蛋白定量肽段在5~200 nmol/L 浓度范围内的标准曲线相关系数良好(R=0.9965)，标线各点的准确度范围在94.0~115.9%；5和50nmol/L浓度的标准曲线点平行测定6次，保留时间的 RSD 不大于 0.06%，峰面积不大于RSD9.92%。实际样品均检出a-乳白蛋白，含量在24.86-52.59 mg/kg。 由于实际样品中α-乳白蛋白含量极低，必须采用 Mikros 捕集系统来提升仪器的灵敏度。该方法可供药检实验室参考。 田岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 上海市徐汇区宜州路180号B2栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cn Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline： 021-34193996 2 µL进样体积下，50 nmol/L α-乳白蛋白标准溶液，Mikros比LC-30A灵敏度提升了约7.4倍。使用Nexera Mikros在线捕集洗脱系统，乳糖在Trap柱上不保留，仅对乳清蛋白的特征肽段在线富集并检测，避免高浓度乳糖堵塞微流量系统。实验结果表明：α-乳白蛋白特异肽段在5~200 nmol/L浓度范围内的标准曲线相关系数良好（R=0.9965），标线各点的准确度范围在94.0~115.9%；5和50 nmol/L浓度的标准溶液平行测定6次，保留时间的RSD不大于0.06%，峰面积RSD不大于9.92%。多份实际样品均检出α-乳白蛋白。