细胞样品中基因的表达和调控检测方案(抗体 试剂盒)

研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 TRIzol RNA提取方法： （1）操作简单的，提取方便，回收率高； （2）提取的RNA的质量高，对cDNA库，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验起着很重要的影响。 实验原理: Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。 实验材料: 细胞样品 试剂\试剂盒: TRIzol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇 DEPC H2O 仪器\耗材: 离心管 离心机 EP管 匀浆器 移液管 冰袋 漩涡振荡器 实验步骤: 1. 样品处理： （1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。 2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。 4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min） 注意事项: 1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。 2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。 其他: 一、RNA的定量计算 1. RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数（n）/1000 2. RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。TRIzol RNA提取方法：（1）操作简单的，提取方便，回收率高；（2）提取的RNA的质量高，对cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验起着很重要的影响。 实验原理:Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。 实验材料: 细胞样品 试剂\试剂盒: TRIzol试剂  氯仿  异丙醇  75%乙醇   DEPC H2O 仪器\耗材: 离心管   离心机  EP管  匀浆器  移液管  冰袋   漩涡振荡器 实验步骤:1. 样品处理： （1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。 2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。 4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min） 注意事项:1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。（2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。 2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。 4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min） 注意事项:1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。