高效感受态细胞中质粒的转化制作检测方案(化学试剂)

高效感受态细胞可用于质粒的转化。 DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组 实验方法原理: 主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 因RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高，本实验操作以此为例说明。 实验材料: 细胞样品 试剂\试剂盒: MnCl2 HEPES CaCl2 SOB 培养基 SOC液体培养基 液氮 仪器\耗材: 水浴锅 三角瓶 玻璃瓶 冷冻离心机 滤膜 离心管 称量天平 实验步骤: 一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉） 酵母粉Yeast Extract 5g 蛋白胨Peptone/g 10g NaCl 10g 水 1000ml 二、TFBI溶液配制 RbCl(氯化铷) 5 g 1 M KAc(醋酸钾) 12.3 ml 1 M CaCl2(氯化钙) 4.1 ml 1 M MnCl2(氯化锰，粉色) 20.5 ml glycerol(甘油) 61.5g 0.1 M HAc(醋酸) 8 ml 调节pH至5.8 超纯水 补足至410ml 注：配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。 三、TFBII溶液配制 1 M MOPS （pH 6.5，溶液为黄色) 1.5 ml 1 M CaCl2(氯化钙) 11.25 ml 1 M RbCl 1.5 ml glycerol(甘油) 22.5 g 1 M KOH(氢氧化钾) 调节pH至6.5 超纯水 补足至150ml 注：配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。 四、高效感受态细胞制备 1. 取实验室-80度保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线，37度培养过夜，进行活化。； 2. 从LB平板上挑取单菌落，尽量选择菌落较饱满，边缘平滑，个头较大、长势较好的菌落； 3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中； 4. 37℃下振荡培养过夜（摇床转速200rpm，12h左右），进行充分活化； 5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h至OD590达0.4~0.6； 6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50mL离心管中，冰上放置10min（此时，可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷了，离心机也要开始预冷了，如果你们的离心机降温较慢，最好再提前一点）； 7. 在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清； 8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液（如果前面使用的是60ml，这里则为60/2.5=24ml），轻轻悬浮细胞，冰上放置10min； 9. 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清； 10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII（如果前面使用的是60ml，这里则为60/25=2.4ml，也即为TBFI的1/10，当然具体体积也可以根据个人经验上下变动），轻轻悬浮菌沉； 11. 分装至EP管中，每管分装100ul（EP管最好预冷，分装过程要求在冰上进行）； 12. -80度长期保存（至少可以保存一年）. 注意事项: 1. 挑选低代数的菌种是关键，千万不要每次活化后保存活化后的菌种，更不要将菌种长期保存在-20度。 2. 大肠杆菌在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长，从而使细菌群体在达到一定的OD值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。 3. 大肠杆菌的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长。 4. 达到细菌对数生长早、中期，需时约2.0——2.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。 5. 低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。 6. 洗涤细胞时细胞较脆弱，悬浮沉淀时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。 7. -80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能. 其他: 为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个因素： 1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过检测培养液的OD600来控制。 2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 3. 试剂的质量：所用的试剂需是最高纯度的（GR或AR），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、移液器吸头等最好是新的，并经过高压灭菌处理，所有的试剂都要过滤除菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 高效感受态细胞可用于质粒的转化。 DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组 实验方法原理:主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。因RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高，本实验操作以此为例说明。 实验材料: 细胞样品 试剂\试剂盒: MnCl2   HEPES  CaCl2    SOB 培养基  SOC液体培养基  液氮 仪器\耗材: 水浴锅  三角瓶  玻璃瓶  冷冻离心机  滤膜  离心管  称量天平 实验步骤:一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉）酵母粉Yeast Extract      5g蛋白胨Peptone/g    10gNaCl                         10g水                      1000ml 二、TFBI溶液配制RbCl(氯化铷)                               5 g1 M KAc(醋酸钾)                   12.3 ml1 M CaCl2(氯化钙)                  4.1 ml1 M MnCl2(氯化锰，粉色)     20.5 mlglycerol(甘油)                         61.5g0.1 M HAc(醋酸)                      8 ml   调节pH至5.8超纯水                         补足至410ml注：配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。