植物中游离脯氨酸含量检测方案(试剂盒)

植物体内游离脯氨酸含量的测定 实验原理: 植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的 疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止 渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。 因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用， 而且即使在含 水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下， 植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定 程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 实验试剂: 3%磺基水杨酸水溶液 甲苯 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液 实验设备 分光光度计 水浴锅 漏斗 20ml大试管数支 20ml具塞刻度试管9支 5～10ml注射器或滴管 实验材料:小麦叶片 实验步骤: 1．标准曲线制作 表1 各试管中试剂加入量 管 号 0 1 2 3 4 5 6 标准脯氨酸量(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 H2O(ml) 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 冰乙酸(ml) 2 2 2 2 2 2 2 显色液(ml) 3 3 3 3 3 3 3 脯氨酸含量(μg) 0 2 4 8 12 16 20 （1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 2．样品测定 （1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。 （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸（μg/g FW或DW）= (C*(V/a)) / W式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）； W—样品重（g）。 注意事项 质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题： 1. 取材的一致性，代表性； 2. 器皿和用具要清洁； 3. 测试条件要一致，如测试温度等要一致； 4. 注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。 实验原理:植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的 疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止 渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。 因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用， 而且即使在含 水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下， 植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定 程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。实验试剂:3%磺基水杨酸水溶液 甲苯 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液 实验设备分光光度计水浴锅漏斗20ml大试管数支20ml具塞刻度试管9支5～10ml注射器或滴管 实验材料:小麦叶片 实验步骤:1．标准曲线制作 表1 各试管中试剂加入量管 号0123456标准脯氨酸量(ml)00.20.40.81.21.62H2O(ml)21.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2222222显色液(ml)3333333脯氨酸含量(μg)0248121620 （1）取7支具塞刻度试管按表38-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。 2．样品测定 （1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。 （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。 脯氨酸（μg/g FW或DW）= (C*(V/a)) / W式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得； V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）； W—样品重（g）。 注意事项质膜相对透性的测定虽简单，但干扰因素多，测定时应注意以下问题： 1. 取材的一致性，代表性；2. 器皿和用具要清洁；3. 测试条件要一致，如测试温度等要一致；4. 注意不同材料其适宜的浸泡时间均不相同。