外源DNA片断中PCR扩增产物的克隆检测方案(离心机)

PCR扩增产物的克隆—TA克隆法 实验方法原理 TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3'T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5'除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3'OH末端与5'端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。 实验材料: 外源DNA片断 试剂、试剂盒：pMD 18-T Vector Ligation buffer T4 ligatease rATP 仪器、耗材：超净工作台 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E8%B6%85%E5%87%80%E5%B7%A5%E4%BD%9C%E5%8F%B0&t=1" \t "_blank​) 离心机 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA&t=1" \t "_blank​) 恒温摇床 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E6%81%92%E6%B8%A9%E6%91%87%E5%BA%8A&t=1" \t "_blank​) 恒温培养箱 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E6%81%92%E6%B8%A9%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%AE%B1&t=1" \t "_blank​) 培养皿 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%9A%BF&t=1" \t "_blank​) 试管 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E8%AF%95%E7%AE%A1&t=1" \t "_blank​) 离心管 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E7%AE%A1&t=1" \t "_blank​) 电泳仪 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E4%BB%AA&t=1" \t "_blank​) 电泳槽 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E6%A7%BD&t=1" \t "_blank​) 凝胶样品梳 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E5%87%9D%E8%83%B6%E6%A0%B7%E5%93%81%E6%A2%B3&t=1" \t "_blank​) 移液器 (​https:​/​​/​www.biomart.cn​/​product​/​s?wd=%E7%A7%BB%E6%B6%B2%E5%99%A8&t=1" \t "_blank​) 实验步骤： 一、大肠杆菌感受态细胞的制备 1. 取大肠杆菌JM109保存液50 ul，接种于4 ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300 rpm振荡培养过夜，第二天取50 ul 转接到新的4 ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，冰浴10 min。 2. 4℃，5 000 rpm离心2 min，去上清液。 3. 加入750 ul预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，冰浴30 min。 4. 4℃，5 000 rpm离心2 min，弃上清液。 5. 加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2 h后，4℃保存备用。 二、重组DNA的转化 1. 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。 2. 于100 ul感受态细胞中加入10 ul连接产物，冰浴30 min。 3. 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2 min。 4. 在离心管中加入SOC培养基300 ul，枪头混匀，37℃、150 rpm温和摇振60 min。 5. 将200 ul 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。 三、重组质粒的鉴定 方案一： 菌落PCR （1） 制备PCR混合液。 （2） 用经灭菌的10 ul 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。 （3） 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。 （4） 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。 （5） 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。 （6） 取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 方案二： 质粒PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒DNA （1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。 （2）用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。 （3）加入250 ul Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。 （4）加入400 ul Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2 min，14 000 rpm离心10 min。 *若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。 （5）将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm离心1 min。 （6） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 ul Buffer W1，5500 rpm离心1 min。 （7）弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700 ul 已加无水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm离心1 min，以同样的方法再用700 ul已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。 （8） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm离心1 min。 （9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去离子水。 （10）室温静置2 min，14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。 （11） 取5 uL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。 （1） 加TE稀释质粒DNA溶液至300 uL。 （2）加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3 min。 （3）14 000 rpm 离心5 min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3 min。 （4） 14 000 rpm离心5 min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3 min。 （5） 14 000rpm离心5 min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15 min，沉淀质粒DNA。 （6） 14 000rpm离心13 min，弃上清液，沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。 （7） 取5 ul样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3. 质粒PCR （1） PCR反应体系如下： （2）PCR 扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为： 94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。 （3） 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。 注意事项： 1. 要获得目的基因的TA克隆 ，PCR 产物的特异性要好。 2. PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。 3. 在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 4. 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。 5. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 6. 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 8. Ligation Solution I 请于冰中融解。 9. 在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。 10. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。 11. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。 12. 连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。 13. 连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。 14. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。 其他问题： 一、常见问题 1. 怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率? （1） 纯化PCR产物，切胶回收的PCR片段最好。 （2）除去残存的引物等杂质。 （3）DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。 2. PCR产物难以插入载体，为什么? （1）确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长，长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。 （2）PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。 （3）确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。 （4）确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。 （5）确认抗生素的浓度是否过大。 （6）最好使用新配制的平板培养基。 3. 转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色)，为什么? 插入的PCR片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacZ基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。 4. 插入的PCR产物进行测序时，可使用何种引物? 本制品的载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的引物都可以使用。 PCR扩增产物的克隆—TA克隆法 实验方法原理TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3'T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最hou产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5'除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3'OH末端与5'端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最da限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。  实验材料: 外源DNA片断 试剂、试剂盒：pMD 18-T Vector    Ligation buffer     T4 ligatease    rATP 仪器、耗材：超净工作台 离心机 恒温摇床 恒温培养箱 培养皿 试管 离心管 电泳仪 电泳槽 凝胶样品梳 移液器  实验步骤： 一、大肠杆菌感受态细胞的制备 1.  取大肠杆菌JM109保存液50 ul，接种于4 ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300 rpm振荡培养过夜，第二天取50 ul 转接到新的4 ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，冰浴10 min。 2.   4℃，5 000 rpm离心2 min，去上清液。 3.  加入750 ul预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，冰浴30 min。 4.   4℃，5 000 rpm离心2 min，弃上清液。 5.  加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2 h后，4℃保存备用。 二、重组DNA的转化 1.  将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。 2.   于100 ul感受态细胞中加入10 ul连接产物，冰浴30 min。 3.  将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2 min。 4.  在离心管中加入SOC培养基300 ul，枪头混匀，37℃、150 rpm温和摇振60 min。 5.  将200 ul 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。 三、重组质粒的鉴定 方案一： 菌落PCR （1） 制备PCR混合液。 （2） 用经灭菌的10 ul 枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。 （3） 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。 （4） 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。 （5） 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。 （6） 取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 方案二： 质粒PCR 1.  碱裂解法少量制备质粒DNA （1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。 （2）用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。 （3）加入250 ul Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。 （4）加入400 ul Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2 min，14 000 rpm离心10 min。 *若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。 （5）将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm离心1 min。 （6） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 ul Buffer W1，5500 rpm离心1 min。 （7）弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700 ul 已加无水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm离心1 min，以同样的方法再用700 ul已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。 （8） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm离心1 min。 （9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去离子水。 （10）室温静置2 min，14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。 （11） 取5 uL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。 2.  抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。 （1） 加TE稀释质粒DNA溶液至300 uL。 （2）加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3 min。 （3）14 000 rpm 离心5 min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3 min。 （4） 14 000 rpm离心5 min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3 min。 （5） 14 000rpm离心5 min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15 min，沉淀质粒DNA。 （6） 14 000rpm离心13 min，弃上清液，沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。 （7） 取5 ul样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。 3.  质粒PCR （1） PCR反应体系如下： （2）PCR 扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为： 94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。 （3） 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。  注意事项： 1.  要获得目的基因的TA克隆 ，PCR 产物的特异性要好。 2.  PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。 3.  在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 4.   制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。 5.  42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。 6.   菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 8.  Ligation Solution I 请于冰中融解。 9.  在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。 10.  克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。 11.  按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。 12.   连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。 13.   连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。 14.   感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。 其他问题：一、常见问题 1.  怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率? （1） 纯化PCR产物，切胶回收的PCR片段最好。 （2）除去残存的引物等杂质。 （3）DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。  2.  PCR产物难以插入载体，为什么? （1）确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长，长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。 （2）PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。 （3）确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。 （4）确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。 （5）确认抗生素的浓度是否过大。 （6）最好使用新配制的平板培养基。 3.  转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色)，为什么? 插入的PCR片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacZ基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。 4.  插入的PCR产物进行测序时，可使用何种引物? 本制品的载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的引物都可以使用。