血浆中辛伐他汀检测方案(液质联用仪)

thermoscientific热线8008105118电话 4006505118www.thermofisher.comThermoFisherSCIENTIFIC133赛默飞色谱和质谱中国 TSQ Quantis LC-MS/MS测定辛伐他汀的药物一致性评价方法学考察 王立杰 蔡悠悠赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 建立一种测定人体血浆中辛伐他汀的LC-MS/MS方法， 质谱采用TSQ Quantis， 离子源为可加热电喷雾离子源( HESI )，正离子检测，扫描方式为多反应监测( SRM)，辛伐他汀和内标的监测离子对分别为m/z 436.2→199.1和442.3→199.1。分析时间为5.5min，辛伐他汀在0.05-50ng/mL浓度范围内线性良好。辛伐他汀定量下限为0.05ng/mL。本方法的灵敏度、精确度和准确度、基质效应、回收率等符合生物样品分析要求，本方法符合法规要求，可以用于药物生物等效性一致性评价的研究。 关键词 辛伐他汀 ， TSQ Quantis， 一致性评价 1.引言 辛伐他汀是由土曲霉内提炼而得，列名于世界卫生组织基本药物清单，属于基础医疗体系必备药物之一[1] O作为一种口服降血脂药物，常见商品名“Zoctor”。该品会在运动、节食，和减肥时服用，以避免发生血脂升高。此外辛伐他汀也可降低高心脏病风险者发作的机会。严重副作用包含肌病变、肝脏伤害，以及血糖升高。 常见副作用则有便秘、头痛，和恶心。有证据显示妊娠期间服用该药物会对胎儿造成伤害，哺乳期间不得使用该品。辛伐他汀属于HMG-CoA还原酶抑制剂，借此抑制肝脏制造胆固醇。鉴于辛伐他汀的广泛用途，越来越多的生产厂开始生产或仿制辛伐他汀制剂。为了方便进行辛伐他汀的生物等效性一致性评价，本文建立一种灵敏、快速、可靠的LC-MS/MS检测方法，并按中国药典按照(CFDA)的指导原则进行了方法学验证。 2.实验部分 2.1仪器与试剂 2.1.1 ThermoFisher Vanquish Horizon 超高效液相色谱仪 2.1.2 ThermoFisher TSQ Quantis三重四杆杆质谱 2.1.3 甲醇，乙腈(HPLC级，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为Milli-Q去离子水； 2.1.4 辛伐他汀标准品购自 TorontoResearchChemicals 2.1.5 实验用人血浆：购买自 Bioreclamation LLC 2.2化合物信息及溶液配制 ( 2.2.1 化合物信息：辛伐他 汀 ( Simvastatin) ，CAS ：79902-63- 9 ，分子式C25H38O5， 分子量418 ) 2.2.2 储备液：精确称取辛伐他汀适量，乙腈溶解，配制储备液 0.5 mg/mL。 2.2.3 工作溶液：以60%乙腈水溶剂，配制系列标准溶液5，25，50，100，2500，12500， ng/mL 2.2.4 标准曲线浓度：由工作溶液用基质配制成系列浓度0.05，0.1，0.5，2，10，25，45，50ng/mL 2.2.5 质控样(QC样品)浓度：由工作溶液用基质配制成浓度0.15，2.5， 37.5ng/mL 2.3血浆样品处理 100mL空白血浆加入100mL 200mM乙酸铵水溶液，用乙酸调PH至4.5，备用。处理后的空白血浆中加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，制备高、中、低质控样品。 2.4色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold (100*2.1mm，3u) 流动相：PH4.0的2.00mM醋酸铵水溶液和乙腈，梯度洗脱，流速为0.4ml/min，分析时间为5.5min。 2.5质谱条件 可加热电喷雾电离源(HESI)，正离子SRM扫描模式；喷雾电压4000V；离子源和离子传输管温度都是350℃；碰撞气压力(氩气)为1.5 mTorr；辛伐他汀和内标的监测离子对分别为m/z 436.2→199.1和442.3→199.1。 2.6方法学验证 按照CFDA的指导原则进行方法学验证 2.6.1 专属性：通过对比空白血浆、加入内标溶液的空白血浆和加入辛伐他汀配制低质控浓度的血浆样品谱图，计算低质控样品的准确度，考察该方法的专属性。 2.6.2 最低定量限：以标准曲线最低浓度点作为质控样品，计算其准确度考察最低定量限。 2.6.3 建立标准曲线：取95pL空白血浆，加入5pL辛伐。分别以辛伐他汀的峰面积与内标峰面积的比值对其 他汀标准工作溶液和内标溶液，经样品前处理后进样分析。 2.6.4 精密度和准确度：高、中、低质控浓度6个样品一日内进样，计算日内精密度和准确度。每个样品连续3日内分别进样分析，计算日间精密度和准确度。 2.6.5回收率和基质效应 血浆样品在沉淀蛋白前和沉淀蛋白后分别加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，计算沉淀前后的比值考察本方法的回收率。在血浆沉淀蛋白后的上清液和60%乙腈水溶液中分别加入辛伐他汀标准溶液和内标溶液，计算两者的比值考察本方法的基质效应。 2.6.6稳定性实验 辛伐他汀储备液、内标储备液、最高与最低两个浓度工作溶液经4℃保存15天，计算4℃保存的溶液与新鲜配制的溶液之间的偏差考察溶液的长期稳定性。高、低两个质控浓度样品经反复冻融、湿冰保存2h和-80℃保存15天、45天，计算质控样品的准确度考察短期与长期稳定性。经过前处理后的同一序列间隔96h分别进样，考察自动进样器的稳定性。 2.6.7稀释效应 将250ng/mL辛伐他汀样品用空白血浆稀释10倍。计算准确度考察稀释对样品测定的影响。 2.7高脂血效应 用高脂血浆配制高、低质控样品，计算准确度考察高脂血效应。 2.8序列大小 计算标准曲线与质控样品的准确度，考察一个序列中最大容纳的样品数量。 3.实验结果和讨论 3.1专属性 通过对比空白血浆、加入内标溶液的空白血浆和加入辛伐他汀配制低质控浓度的血浆样品色谱图，并低质控浓度样品的准确度，结果如下。说明血浆中内源性物质对辛伐他汀和内标的检测没有干扰。 图1.空白血浆样品 表1. 方法选择性 Selectivity Data for Simvastatin in Human plasma 图2.加入内标溶液的空白血浆 图3.加入辛伐他汀的低质控浓度血浆样品 Matrix ID Theoretical Concentration(0.15ng/mL) Accuracy (%) Lot1-1 0.162 108.0 Lot1-2 0.172 114.7 Lot1-3 0.165 110.0 Lot2-1 0.149 99.3 Lot2-2 0.161 107.3 Lot2-3 0.144 96.0 Lot3-1 0.157 104.7 Lot3-2 0.145 96.7 Lot3-3 0.186 124.0 Lot4-1 0.162 108.0 Lot4-2 0.17 113.3 Lot4-3 0.147 98.0 Lot5-1 0.14 93.3 Lot5-2 0.171 114.0 Lot5-3 0.204 136.0 n 15 Mean 0.159 SD 0.0104 RSD (%) 6.5 Accuracy (%) 106 3.2线性 辛伐他汀在 0.05-50ng/mL浓度范围内线性良好，线性相关系数r均大于0.99.。 表2辛伐他汀在人血浆中的校准曲线结果及数据 Calibration Curve Data for Simvastatin in Human plasma Analysis Group Slope Y-Intercept Correlation Coefficient 1 55.64169183 -0.082251526 0.9956 2 55.01285927 0.294891413 0.9974 3 53.47304402 0.833452586 0.9954 Theoretical Concentration (ng/mL) Analysis 0.05 0.1 0.5 2 10 25 45 50 Group 001 0.053 *0.120 0.45 2.017 9.469 24.606 44.949 50.751 0.044 0.111 0.48 2.117 10.009 24.802 45.415 52.846 002 0.05 *0.083 0.472 1.872 10.37 24.788 46.422 49.323 0.053 0.089 0.52 1.97 10.407 25.146 45.394 52.321 003 0.046 0.118 0.501 2.104 9.891 24.573 45.424 51.926 *0.034 0.1 0.499 1.869 9.44 25.251 45.054 47.543 n 5 4 6 6 6 6 6 6 Mean 0.0492 0.106 0.485 2.02 10 24.8 45.5 51.4 SD 0.00409 0.0151 0.0269 0.101 0.385 0.228 0.542 1.41 RSD(%) 8.3 14.2 5.5 5 3.9 0.9 1.2 2.7 Accuracy(%) 98.4 106 97 101 100 99.2 101.1 102.8 * Failed acceptance criteria 3.3最低定量限 辛伐他汀样品的最低定量限为 0.05ng/mL。 表3辛伐他汀在人血浆样品的灵敏度 Sensitivity Data for Simvastatin in Human plasma 3.4精密度和准确度 辛伐他汀高、中、低浓度质控样品的日间和日内精密度和准确度均小于15%，低浓度小于20%，符合生物样品分析要求。 表4辛伐他汀质控样品的精密度和准确度 Quality Control Sample Data for Simvastatin in Human plasma 3.5回收率和基质效应 辛伐他汀低、中、高质控样品的回收率分别在98.2%、96%和91.1%，内标低、中、高质控样品的回收率为90.8%、88.1%和87.3%，说明本实验前处理方法合适。辛伐他汀低、高质控样品经过内标归一化的基质效应分别为 0.981 和1.000，说明本方法没有显著的基质效应。 表5 人血浆样品中辛伐他汀的回收率 Recovery Data for Simvastatin and the Internal Standard in Human plasma 表66人血浆样品中辛伐他汀的基质效应 Matrix Factor Data for Simvastatin and the Internal Standard in Human plasma Matrix ID Post Extraction Post Extraction ISTD Normalized Matrix ID Spike Peak Area Spike Peak Area Peak Area Peak Area Peak Area Peak Area Factor Matrix Factor Spike Peak Area Spike Peak Area Peak Area Peak Area Solution Peak Area Solution Peak Area Factor MatrixFactor Matrix Factor Matrix Factor Lot1 217534 304163 293171.7 0.742 9578 12829 12389 0.734 1.01 Lot2 218332 289525 0.745 9133 12318 0.7 1.06 Lot3 219329 285827 0.748 9731 12020 0.746 1 Lot4 225575 0.769 10225 0.783 0.982 Lot5 217642 0.742 10051 0.77 0.964 Lot6 213755 0.729 9500 0.728 0.927 n 6 6 6 Mean 0.746 0.744 1 SD 0.0131 0.03 0.0325 RSD (%) 1.8 4 3.3 3.6稳定性 辛伐他汀储备液、内标储备液、最高与最低两个浓度工作溶液在4℃保存15天的条件下稳定。 表7辛伐他汀溶液的稳定性(4℃ 存储 15 Days) Solution Stability for Simvastatin Stored at 4℃ for 15 Days Stock Standard Solution Stock Internal Standard Solution Lowest Concentration Working Solution Highest Concentration Working Solution Time 0 Days 15 Days 0 Days 15 Days 0 Days 15 Days 0 Days 15 Days Peak Area Ratio 2.4779 2.3844 0.4036 0.4194 0.0295 0.0271 1.2133 1.1432 Peak Area Ratio 2.444 2.3874 0.4092 0.4189 0.0293 0.027 1.2139 1.1494 Peak Area Ratio 2.4665 2.4006 0.4054 0.4166 0.0293 0.0267 1.2178 1.1496 Peak Area Ratio 2.4706 2.4095 0.4048 0.415 0.0293 0.0264 1.2161 1.1514 Peak Area Ratio 2.48 2.4077 0.4032 0.4153 0.0296 0.0269 ：1.2113 1.1506 Peak Area Ratio 2.4865 2.4093 0.4022 0.4151 0.029 0.0272 1.2157 1.1427 n 6 6 6 6 6 6 6 6 Mean Peak 2.47 2.4 0.405 0.417 0.0293 0.0269 1.21 1.15 Area Ratio Combined Mean 2.44 2.96 -8.2 -4.96 辛伐他汀低、高浓度质控样品样反复冻融4次、湿冰保存 2h 和-80℃保存15天、45天的条件下稳定。 表8 短期稳定性测试结果(反复冻融4次，湿冰保存2h) 表99长期稳定性测试结果(-80℃保存15天、45天) Short-Term Matrix Stability Data for Simvastatin in Human plasma Long-Term Matrix Stability Data for Simvastatin in Human plasma Concentration After Storage at-80℃ for 15 Days 0.15 Diff (%) 37.5 Diff (%) TheoreticalConcentration (ng/mL) 0.15 Diff(%) 37.5 Diff (%) 0.156 4 40.358 7.6 0.161 7.3 40.952 9.2 0.176 17.3 40.714 8.6 0.149 -0.7 35.808 -4.5 0.16 6.7 37.42 -0.2 0.173 15.3 38.238 2 n 6 6 Mean 0.163 38.9 SD 0.0103 2.09 RSD (%) 6.3 5.4 Accuracy (%) 108.7 103.7 2 Hours at Wet Ice After Storage at -80℃ for 45 Days 0.152 1.3 38.794 3.5 TheoreticalConcentration (ng/mL) 0.15 Diff (%) 37.5 Diff (%) 0.154 2.7 31.011 -17.3 0.164 9.3 32.96 -12.1 0.164 9.3 34.333 -8.4 0.142 -5.3 34.346 -8.4 n 0.129 -14 30.482 -18.7 Mean 0.18 20 35.328 -5.8 n 6 6 Mean 0.156 33.1 SD 0.0181 1.96 RSD (%) 11.6 5.9 Accuracy (%) 104 88.3 经过前处理后的样品序列在自动进样器中存放96h 稳定性良好 表10)处理后样品自动进样器存放96h 稳定性结果 Reinjection Reproducibility Data for Simvastatin in Human plasma Storage at 4℃ for 96 Hours Theoreticall Concentration (ng/mL) Calculated Concentration (ng/mL) Diff (%) 0.15 0.156 4 0.165 10 0.166 10.7 0.167 11.3 0.155 3.3 0.17 13.3 Mean 0.163 Accuracy (%) 108.7 2.5 2.618 4.7 2.581 3.2 2.867 14.7 2.73 9.2 2.721 8.8 2.776 11 Mean 2.72 Accuracy (%) 108.8 37.5 41.46 10.6 39.806 6.1 40.248 7.3 39.148 4.4 41.733 11.3 40.487 8 Mean 40.5 Accuracy (%) 108 Original Analysis Group： 3 Reinjection Analysis Date： 96 hours Slope： 53.47304402 Slope： 53.55975644 y-lntercept： 0.833452586 y-Intercept： 1.007984204 Correlation Coefficient： 0.9954 Correlation Coefficient： 0.9957 3.7序列大小 经测定一个序列中最大可容纳192个样品 3.8稀释效应 辛伐他汀 250ng/mL浓度样品经10倍积积稀释后测定其准确度和精密度分别为9.9%和3.8%，符合法规要求。 表11 辛伐他汀稀释效应测试结果 Theoretical Concentration (ng/mL) 10X Dilution Diff(%) 250 23.807 -90.5 24.004 -90.4 25.778 -89.7 25.394 -89.8 24.139 -90.3 25.858 -89.7 n 6 Mean 24.8 SD 0.947 RSD(%) 3.8 Accuracy (%) 9.9 3.9高脂血效应 辛伐他汀低、高浓度高脂血样品测定准确度分别为102%和104.8%，符合法规要求。 表12辛伐他汀高脂血样品测试结果 Theoretical Concentration 0.15 (ng/mL) 37.5 (ng/mL) 0.154 39.789 0.147 39.196 0.16 40.651 0.147 37.758 0.154 38.068 0.157 40.528 n 6 6 Mean 0.153 39.3 SD 0.00527 1.22 RSD (%) 3.4 3.1 Accuracy (%) 102 104.8 4.结论 本文建立了一种灵敏、快速的测定辛伐他汀的LC-MS/MS方法，经方法学验证本方法的专属性、精密度和准确度、基质效应、回收率和稳定性等符合生物样品分析法规要求，适用于药物生物等效性一致性评价研究。  建立一种测定人体血浆中辛伐他汀的LC-MS/MS方法， 质谱采用TSQ Quantis, 离子源为可加热电喷雾离子源（HESI），正离子检测，扫描方式为多反应监测（SRM），辛伐他汀和内标的监测离子对分别为m/z 436.2→199.1和442.3→199.1。分析时间为5.5min，辛伐他汀在0.05-50ng/mL浓度范围内线性良好。辛伐他汀定量下限为0.05ng/mL。本方法的灵敏度、精确度和准确度、基质效应、回收率等符合生物样品分析要求，本方法符合法规要求，可以用于药物生物等效性一致性评价的研究。本文建立了一种灵敏、快速的测定辛伐他汀的LC-MS/MS方法，经方法学验证本方法的专属性、精密度和准确度、基质 效应、回收率和稳定性等符合生物样品分析法规要求，适用于药物生物等效性一致性评价研究。