药品中黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2检测方案(液质联用仪)

thermoscientific 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎ 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 药典中黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的液相色谱质谱检测分析 潘峰云郭藤徐牛生赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词 黄曲霉毒素B1， B2，G1，G22TTSQ Altis 摘要 赛默飞全新液相色谱串联三重四极杆质谱TSQ Altis平台针对《中国药典》2015版黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2分析要求建立了高灵敏的检测方法。在其适宜的浓度范围内线性关系良好(r2>0.99)，定量限远优于药典规定的检测要求，并且重现性好。按照药典的前处理方法，所得70%甲醇的样品溶剂，可以直接运用本检测方法，所得色谱峰形良好，结果准确可靠。 1.引言 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素(aflatoxins)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要有B1， B2， G1， G2以及其他代谢物。 《中国药典》2015版要求对药材，饮片和制剂中黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)，黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)建立高灵敏度分析检测方法，其中黄曲霉毒素B2，G2最低浓度点0.04ng/ml， 黄曲霉毒素B1，G1最低浓度点 是0.12ng/ml。 本文建立了基于Thermo Fisher Scientific TSQ Altis三重四极杆串联质谱仪对AFB1， AFB2， AFG1和AFG2的高灵敏检测方法。本方法灵敏度高，按照药典前处理后的70%甲醇的样品溶液，可以直接运用本检测方法，获得的色谱峰形良好，稳定性和重现性优异，远优于药典中对药材，饮片，及制剂中黄曲霉毒素的检测要求。 2.2.2实验中配制的四个黄曲霉毒素化合物标准品溶液各浓度度下表2： 化合物 STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 STD7 STD8 STD9 STD10 STD11 AFB1 0.545 1.09 2.18 5.45 10.9 27.25 54.5 109 545 1090 5450 AFB2 0.195 0.39 0.78 1.95 3.9 9.75 19.5 39 195 390 1950 AFG1 0.495 0.99 1.98 4.95 9.9 24.75 49.5 99 495 990 4950 AFG2 0.32 0.64 1.28 3.2 6.4 16 32 64 320 640 3200 表2黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2配制的各浓度(单位pg/ml，溶剂70%甲醇) 色谱柱： Thermo Hypersil GOLD(1.9 pm， 100x2.1mm)；柱温：35℃； 进样量：5uL； 流动相：A为水(含2 mmol/L醋酸铵)，B为甲醇(含2 mmol/L醋酸铵)，梯度洗脱程序(表3) 表3梯度洗脱程序 时间 min A B 流速 0 90 10 0.3 5 10 90 0.3 7 0 100 0.3 7.1 90 10 0.3 9 90 10 0.3 2.4质谱条件： 可加热电喷雾电离源(HESI)，正离子扫描模式；扫描方式： SRM；喷雾电压(+)：3100V；离子传输管温度：300℃；鞘气压力50 arb；辅助气压力 5arb；离子源温度：350℃；碰撞气压力：2mTorr；选择反应监测离子对信息见表4。 表44个黄曲霉毒素化合物质谱采集参数 Precursor Product Collision RF Lens Compound (m/z) (m/z) Energy (V) (V) AFB1 312.912 285* 23.72 84 AFB1 312.912 240.988 38.77 84 AFB1 312.912 269 32.25 84 AFB2 314.962 287.071* 26.42 84 AFB2 314.962 258.97 30.28 84 AFG1 329 243* 27.21 75 AFG1 329 310.97 22.17 75 AFG2 330.912 245* 30.89 88 AFG2 330.912 313 24.97 88 注：带*的为定量子离子 采用上述仪器分析方法，70%甲醇溶剂的AFB1，AFB2，AFG1，AFG2标准品溶液，四个化合物均可获得良好的色谱峰，图1为化合物LOQ处的选择离子流提取图，各化合物灵敏度测试结果见表5。 图1AFB1，AFB2，AFG1，AFG2化合物的色谱图(LOQ，进样体积5uL) 3.2线性范围测试及重现性试验 采用上述仪器分析方法，对黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2进行线性范围测试，线性相关系数r2均大于0.99，线性关系良好。对4种黄曲霉毒素化合物定量限LOQ标准品溶液重复进样六次，进行相对标准偏差RSD测试，实验结果证明4个化合物RSD%均小于5%。化合物线性范围、线性相关系数、检测限，定量限及定量限的相对标准偏差结果见表4，化合物线性方程图见图2。 表5 4种化合物的线性范围、线性相关系数及LOD、LOQ、RSD 线性范围 相关系数 LOD LOQ LOQ 化合物 RSD% (n=6) (pg/mL) (r2) (pg/mL) (pg/mL) AFB1 2.18-5450 0.9994 0.5 2.18 2.98 AFB2 1.95-1950 0.9993 0.2 1.95 4.98 AFG1 4.95-4950 0.9996 0.5 4.95 4.05 AFG2 6.40-3200 0.9993 0.6 6.40 2.88 .B1 AFB2 线性范围0.00195~1.95ng/ml AFG2 线性范围0.0064~3.2ng/ml AFG1 线性范围0.00495~4.95ng/ml 图24种化合物线性方程图 3.3基质效应 空白基质，低中高浓度标准溶液，以及空白基质加标溶液分别进样考察基质效应。结果见表6。 空白基质加低浓度标品溶液见 图3 RT：0.00-10.00 SM： 7G 图3基质效应考察低浓度谱图 基质加标峰面积/ 标准品峰面积 std4低浓度 std7中浓度 std10高浓度 Average AFB1 比值 97.40% 95.40% 94.20% 95.60% AFB2 比值 81.80% 78.70% 77.10% 79.20% AFG1 比值 92.40% 99.50% 97.40% 96.50% AFG2 比值 101.50% 91.50% 91.40% 94.80% 表6基质效应考察(低中高浓度) 由表格数据得出，此方法中AFB1， AFG1，AFG2基质效应在10%之内， AFB2基质效应大约20%。 |RT：0.00-10.00 SM： 7G 4.总结 本文建立了三重四极杆液质联用仪(TSQ Altis)分析中国药典规定的黄曲霉毒素B1， B2， G1和G2的检测方法。建立的方法灵敏度高，检测限均小于1ppt，色谱峰形良好，同时具备优异的重现性，远优于药典中对药材，饮片，及制剂中黄曲霉毒素的检测要求。 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素（aflatoxins)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要有B1，B2，G1，G2以及其他代谢物。《中国药典》2015版要求对药材，饮片和制剂中黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2），黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）建立高灵敏度分析检测方法，其中黄曲霉毒素B2,G2最低浓度点0.04ng/ml, 黄曲霉毒素B1,G1最低浓度点是0.12ng/ml。本文建立了基于Thermo Fisher Scientific TSQ Altis三重四极杆串联质谱仪对AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的高灵敏检测方法。本方法灵敏度高，按照药典前处理后的70%甲醇的样品溶液，可以直接运用本检测方法，获得的色谱峰形良好，稳定性和重现性优异，远优于药典中对药材，饮片，及制剂中黄曲霉毒素的检测要求。本文建立了三重四极杆液质联用仪（TSQ Altis）分析中国药典规定的黄曲霉毒素B1, B2, G1和G2的检测方法。建立的方法灵敏度高，检测限均小于1ppt, 色谱峰形良好，同时具备优异的重现性，远优于药典中对药材，饮片，及制剂中黄曲霉毒素的检测要求。