大蒜中黄酮和酚酸检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA14-656Excellence in Science Excellence in ScienceSFC-010 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 离线 SFE 萃取 SFC-MS联用检测大蒜中的9种黄酮和酚酸类营养成分 SFC-010 摘要：本实验使用岛津 Nexera UC 离线 SFE 萃取 SFC-MS 联用建立了大蒜中阿魏酸等9种有效成分的检测方法。样品前处理简单，绿色环保且自动化程度高。萃取过程在封闭的萃取罐中进行，有效避免样品氧化和分解。使用Shim-pack UC-X Diol色谱柱，0.1mM草酸1mM甲酸铵甲醇做改性剂，9种目标物高效分离。0.02~4 pg 范围内基质匹配外标法建立校准曲线(阿魏酸和柚皮素在 0.01~4 ug)，线性范围宽，相关系数R大于0.99， 各标准点准确度在91.2~110.5%之间。在0.4 ug 和1 ug加标量下考察萃取回收率和重复性，离线 SFE萃取各组分定量结果的相对标准偏差在5.5~13.2%之间，回收率在63.0~131.5%，可以满足定量分析的需求。本法用于市售多份大蒜、洋葱实际样品检测。 大蒜为百合科葱属植物，是亚洲地区的主要调味品和保健品，具有较强的抗氧化、杀菌、抗衰老和抗动脉硬化的功能。研究表明，含硫氨基酸、黄酮和多酚类化合物是大蒜中的重要功能成分，具有清除自由基，抗氧化的功效。但是这类物质不稳定，使用传统的溶剂萃取方式易发生分解。 超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE) 是以超临界流体和少量改性剂为萃取剂的新型高效萃取技术。超临界 CO，(scCO，)以其安全、价廉、无毒、易制得、化学学性等因素成为 SFE 最常用的萃取剂。萃 取过程在封闭的腔体中进行，全程隔绝空气，特别适合易氧化组分的萃取。 SFC-MS 系统是岛津最新推出的超临界流体色谱质谱联用产品。超临界流体具有低黏度、高扩散性和高溶解性等特点，使得 SFC 分析具有快速、高效、高分离等优势。本实验使用离线 SFE 萃取， SFC-MS联用系统检测大蒜中的黄酮和多酚类物质，该法前处理简单，自动化程度高，所需样品量少。本系统在大蒜产地鉴别以及地理标志产品领域具有广阔的应用前景。 1.1仪器 Nexera UC 离线 SFE 萃取 SFC-MS联用系统，具体配置为：SFE-30A(超临界流体萃取单元)， SIL-30AC(自动进样器)， LC-30ADSF(CO，输液泵)， LC-20ADXR(输液泵，含LPGU低压梯度比例阀)， LC-20AD(补偿泵)，DGU-20A5×2(在线脱气机)， CTO-20AC(柱温箱)， SFC-30Ax2( 背压调节单元)， CBM-20A(系统控制器)， LCMS-8040(三重四极杆质谱仪)配ESI电离源， LabSolutions Ver5.86(色谱工作站)。 1.2样品信息 化合物信息见表1。 标准溶液配制方法如下：分别取阿魏酸、香豆酸、柚皮素、芹菜素、原儿茶酸、异鼠李素、木犀草素、邻苯二甲酸和檞皮素5 mg，用甲醇超声溶解定容至10mL，配制成单一标准溶液。上述9种单一标准溶液各容400pL， 甲醇定容至5 mL 配制成 40 mg/L 混合标准溶液母液。再用甲醇稀释成0.1、0.2、1、2、10、20 ug/mL 的混合工作溶液。 外标法制备基质匹配标准曲线，萃取罐制备方法如下：随机选取山东苍州大蒜10瓣，去皮压碎，并用研钵混匀。分别称取6份蒜泥于样品舟中，每份0.5g。分别加入0.1、0.2、1、2、10、20、40 ug/mL 混标溶液 100 pL 在蒜泥表面，然后向每份样品舟中加入0.5g脱水剂，一次性药勺搅拌均匀后装入萃取罐进行 offline SFE 萃取。 洋葱、黑蒜、韭菜等实际样品测试 SFE 萃取罐制备方法如下：称取0.5g匀质后的市材与0.5g脱水剂混匀装填至5mL萃取罐中压紧。 表11化合物信息 No. 名称 英文名 CAS# 分子式 1 阿魏酸 Ferulic Acid 1135-24-6 C10H10O4 2 香豆酸 Coumalic acid 500-05-0 C6H4O4 3 柚皮素 Naringenin 480-41-1 C15H12O5 4 芹菜素 Apigenin 520-36-5 C15H10Os 5 原儿茶酸 3，4-Dihydroxybenzoic acid 99-50-3 C7H6O4 6 异鼠李素 Isorhamnetin 480-19-3 C16H12O7 7 木犀草素 Luteolin 491-70-3 C15H10O6 8 邻苯二甲酸 Phthalic acid 88-99-3 C8H6O4 9 槲皮素 Quercetin 117-39-5 C15H1007 1.3分析条件 SFE 萃取条件 萃取剂： A-scCO； B-MeOH 静态萃取：4min* 萃取流速：3mL/min 动态萃取：9 min 静态萃取剂比例： A/B=70/30(v/v) 萃取背压： A-40 MPa；B-10 MPa 动态萃取剂比例： A/B=70/30(v/v) 注：*包括1分钟充填时间 萃取温度：50℃ SFC 色谱条件 色谱柱： Shim-pack UC-X Diol(4.6 mm I.D.×150 mm L.，3 pm) 背压： A-10MPa；B-40 MPa 流动相： A-scCOz； B-0.1 mM 草酸1mM 甲酸铵MeOH 补偿液：甲醇洗脱方式：梯度洗脱：30%B(0-2 min)-40%B(3 min)-50%B(6-8 min)* 柱温：40℃ *8-12 min 为甲醇冲洗色谱柱 质谱条件 离子源： ESI- 加热模块温温：400℃ 雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速：15.0L/min 接口电压：4kV 驻留时间：9~24 ms DL 温度：230℃ MRM参数：见表2 表2 MRM参数 No 名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 阿魏酸 193.10 134.10* 14 18 12 193.10 178.00 14 15 17 2 香豆酸 163.00 119.10* 18 16 11 163.00 91.00 12 29 16 3 柚皮素 271.10 151.00* 30 17 15 271.10 119.10 30 24 11 4 芹菜素 269.10 117.10* 20 34 11 269.10 151.00 20 24 14 5 原儿茶酸 153.10 109.10* 30 15 10 153.10 91.00 30 26 30 6 异鼠李素 315.10 300.00* 23 21 13 315.10 151.00 23 28 14 木犀草素 285.10 133.10* 21 32 12 285.10 151.00 20 25 14 8 邻苯二甲酸 165.10 77.10* 12 16 10 165.10 121.00 12 13 11 .9 皮素 301.10 179.00* 22 17 17 301.10 151.00 22 21 15 *表示定量离子 结果与讨论 2.1 SFC-MS 色谱图 对阿魏酸等9种标准品进行 SFC-MS分离条件优化。目标组分组硅胶柱上没有保留， 0.5 min 之前所有组分出峰完毕。在C18柱上各组分出峰集中在1~3min， 且异鼠李素峰形展宽。在氨基柱上邻苯二甲酸、原儿茶酸和木犀草素保留过强，不洗脱。在二醇基柱上各组分峰形尖锐，分离度好。因此最后选取 Shim-pack UC-X Diol 为分析柱。改性剂甲醇中加入0.1 mM草酸1 mM甲酸铵可消除酚酸的拖尾。另外，由于草酸在scCO， 中溶解度低，时间程序中设置了8~12分钟为纯甲醇冲洗柱子，避免草酸析出导致柱压升高。优化后最佳的 SFC-MS 色谱图见图1。 图11SFC-MS标样检测色谱图(阿魏酸、香豆酸、柚皮素、芹菜素、原儿茶酸、异鼠李素、木犀草素、邻苯二甲酸和檞皮素浓度为100 ng/mL) 2.2基质效应评价 大蒜中含有大蒜素、蒜氨酸和挥发油，可能会与目标组分共洗脱而产生基质效应。为了考察各组分的基质效应，分别用大蒜基质和甲醇配制以下系列工作溶液： 5、10、20、50、100、200、500和1000 ng/mL 得到两条工作曲线，用C%进行基质效应评价，计算公式如下： C%=(1-Ss/Sm)×100 其中， Ss 为基质匹配工作曲线的斜率；Sm 为溶液标曲的斜率。当-50%50%表现为强的基质抑制作用，当C%<-50%表现为强的基质促进作用。实验结果见表3，大蒜基质对9种目标组分均有较强的基质抑制作用。因此后续使用基质匹配外标法建立工作曲线。 表3大蒜基质对9种目标组分基质效应考察 No. 名称 C% 1 阿魏酸 97.2 2 香豆酸 91.7 3 柚皮素 53.2 4 芹菜素 86.3 5 原儿茶酸 66.1 6 异鼠李素 89.0 7 木犀草素 68.5 8 邻苯二甲酸 54.8 9 槲皮素 56.6 2.3线性范围 按照1.2所述标样萃取罐的制备方法制得7个萃取罐，按照1.3所述分析条件进行测定。以萃取罐中目标物的质量为横坐标，以目标峰面积为纵坐标，外标法制作工作曲线，各组分线性回归方程及相关系数见表4。实验结果表明各组分在考察范围内线性关系良好，线性相关系数R大于0.99，各标准点准确度在 91.2~110.5%之间。使用LabSolutions 软件 ASTM 法计算最低标准样品的信噪比，由信噪比计算结果计算得到目标组分定量限(LOQ， S/N=10)在0.001~0.02之间。 表4各组分标准曲线及相关系数 No. 名称 线性范围 (ug) 线性方程 相关系数 Accuracy (%) LOQ(ug) 1 阿魏酸 0.01-4 Y=43016.5X-191.094 0.9943 94.4-104.9 0.003 2 香豆酸 0.02-4 Y=190429X+4373.58 0.9976 94.9-106.9 0.02 3 柚皮素 0.01-4 Y=181874X+840.111 0.9966 92.1-107.2 0.01 4 芹菜素 0.02-4 Y=121919X+4672.02 0.9946 93.6-109.9 0.02 5 原儿茶酸 0.02-4 Y=172508X+6390.82 0.9995 97.5-102.7 0.02 6 异鼠李素 0.02-4 Y=1164330X+43451.2 0.9996 91.6-110.3 0.001 7 木犀草素 0.02-4 Y=486205X+51412.0 0.9962 94.4-108.4 0.001 8 邻苯二甲酸 0.02-4 Y=168267X+23429.8 0.9933 91.2-110.5 0.02 9 槲皮素 0.02-4 Y=18925.4X-107.708 0.9993 93.0-104.1 0.02 2.4重复性和回收率考察 平行制备多个萃取罐，每个萃取罐中加入0.5g蒜泥，在0.4 ug 和1 ug加标量下考察萃取回收率和重复性，结果如表5所示。实验结果表明，离线 SFE 萃取各组分定量结果的相对标准偏差在 5.5~13.2%之间，回收率在63.0~131.5%，可以满足定量分析的需求。 表55彳各组分的离线SFE萃取重复性考察结果(n=6) No. 名称 0.4ug加标结果 lug加标结果 样品测 加标样平 加标样平 CV (%) 试值(ug) 均实测值 CV (%) 回收率(%) 均实测值 回收率(%) (ug) (pg) 1 阿魏酸 0.40 0.99 9.88 115.0-131.5 1.16 9.08 64.1-86.5 2 香豆酸 0.05 0.46 7.63 92.7-118.8 0.93 10.7 76.3-99.8 3 柚皮素 - 0.36 8.77 77.2-96.8 0.92 8.50 82.4-105.1 4 芹菜素 - 0.35 9.74 78.8-99 0.83 7.89 76.2-93.6 5 原儿茶酸 - 0.30 10.7 63.0-91.2 0.90 10.3 79.9-103.9 6 异鼠李素 0.06 0.38 5.50 70.8-84.8 0.89 10.4 72.4-94.1 7 木犀草素 - 0.32 6.73 74.0-88.5 0.82 9.8 75.4-94.7 8 邻苯二甲酸 - 0.36 9.84 77.8-100.2 0.89 10.6 75.2-101.6 9 槲皮素 - 0.27 13.2 66.6-76.5 0.93 11.7 79.7-110.4 2.5实际样品检测 使用本文开发的方法对多份百合科葱属作物进行含量测定。样品中各目标组分的含量测定结果见表6，典型色谱图见图2。 图2实际样品检测色谱图 表6实际样品中各组分含量测定结果(ug/g， n=2) No. 名称 黑蒜 韭菜 紫皮洋葱 1 阿魏酸 - 9.4 - 2 香豆酸 - 0.20 - 3 柚皮素 - - 4 芹菜素 - - 5 原儿茶酸 0.31 一 - 6 异鼠李素 - 0.11 1.02 7 木犀草素 - - - 8 邻苯二甲酸 0.14 - - 9 桷皮素 25.6 结论 本文使用岛津 Nexera UC 离线 SFE 萃取 SFC-MS 联用检测大蒜中9种黄酮和酚酸类营养成分。该方法采用超临界流体萃取样品 (SFE)简化了前处理操作，具有快速、稳定、所需样品量少、绿色环保等优点。本系统在大蒜产地鉴别以及地理标志产品领域具有广阔的应用前景。 岛津全球应用技术开发支持中心 SFC-LCMS系统是岛津最新推出的超临界流体色谱质谱联用产品。超临界流体具有低黏度、高扩散性和高溶解性等特点，使得SFC分析具有快速、高效、高分离等优势。本实验使用岛津Nexera UC离线SFE萃取SFC-LCMS联用建立了大蒜中阿魏酸等9种有效成分的检测方法。样品前处理简单，绿色环保且自动化程度高。萃取过程在封闭的萃取罐中进行，有效避免样品氧化和分解。本系统在大蒜产地鉴别以及地理标志产品领域具有广阔的应用前景。