谷物中3-乙酰化脱氧雪 腐镰刀菌烯醇检测方案(液质联用仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 应用优势 简单、快速且有效的净化方案去除谷物样品中脂肪和磷脂 快速、灵敏的UPLC-MS/MS分析 高效、省时的整体应用解决方案 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC°系统 Xevo°TQ-XS串联四极杆质谱仪 Oasis°PRiME HLB小柱 DisQuE真菌毒素净化管 ACQUITY UPLCCSH Fluoro-Phenyl色谱柱 关键词 谷物，真菌毒素， Oasis° PRiME HLB，ACQUITYUPLC° CSH Fluoro-Pheny，UPLC-MS/MS 背景 真菌毒素是由存在于家畜、饲料和食物上的霉菌或其它真菌产生的一类有毒化合物，摄取的食物中仅含ppb(ug/kg)浓度的真菌毒素就有可能引发严重疾病。因此，我们需要灵敏可靠的分析方法来测定食品和饲料中的霉菌毒素。农产品中面粉、大米和玉米等是最易受到污染的谷物，因此也是监测的重点。这些谷物中有许多天然成分都是LC-MS/MS分析的干扰物。虽然蛋白质和淀粉可通过QuEChERS提取过程中的层析、沉淀和离心步骤去除，但是大量脂肪和卵磷脂(磷脂)仍会随目标物霉菌毒素被共同提取出来。这些共提物会干扰LC-MS分析、污染色谱柱和UPLC系统、质谱仪。传统方法主要采用正己烷脱脂或使用反相吸附剂(如硅胶C，)去除提取物中的脂肪。尽管这些技术可有效去除脂肪，但都无法去除磷脂。 解决方案 使用Oasis PRiME HLB小柱进行通过式净化以去除脂肪和磷脂；通过dSPE(分散SPE)净化去除残留的糖类和其它极性物质。应用上述净化方案可以得到满意的回收率。 仪器条件 UPLC-MS/MS仪器条件如下所示。表1列出了本应用的目标化合物、MRM多反应监测通道和质谱参数。 UPLC条件 LC系统： ACQUITYUPLCI-Class色谱柱： ACQUITY UPLC CSHFluoro-Phenyl，1.7um，2.1mmx100mm流动相： A： 水(0.1%甲酸)B： 乙腈(0.1%甲酸) 梯度洗脱程序： 时间 流速 梯度 (min) (mL/min) A% B% 曲线 初始 0.4 95 5 6 0.8 0.4 95 5 6 8.0 0.4 40 60 6 9.0 0.4 5 95 6 12.0 0.4 5 95 6 15.0 0.4 95 5 1 进样体积： 10 pL 柱温： 40°C 洗针液和样品 管理器冲洗液： 甲醇/水(50：50)溶液密封清洗液： 甲醇/水(10：90)溶液 MS条件 质谱仪： Waters XevoTQ-XS 离子源： ESI+ 离子源温度： 150°C 离子源温度： 500°C 脱溶剂气流速： 1000L/Hr 锥孔气流速： 150L/Hr 数据管理系统： MassLynx°v4.1 样品前处理 样品提取：取2.0g均质样品于50mL离心管中，加入10mL水溶液，漩涡混合30 s， 再加入10mL甲酸/乙腈(10：90)溶液，置于自动振荡器中振荡60 min， 加入QuEChERS盐包(用于CEN方法的DisQuE提取盐包，部件号186006813)后大力振摇1 min， 在3200rpm的转速下，离心5 min。 样品净化：将Oasis PRiME HLB小柱(3cc， 150 mg， 部件号186008717)安装在预先清洁过且设置为最小真空度(大约2 psi)的真空萃取装置上。无需执行小柱活化步骤。取约0.4mL上清液，使其通过Oasis PRiME小柱并弃去滤液。然后再取1mL上清液，再次通过小柱并收集滤液。然后将收集到的流出液转移到含有混合吸附剂的2mLdSPE管(部件号186008081)中。在13500转/分钟下离心1 min， 取500pL上清液，在温和的气气流中挥干，然后复溶于250pL乙腈/水(15：85)中。 化合物名称 缩写 母离子 锥孔 电压 子离子 碰撞 能量 离子化 模式 脱氧雪腐镰刀菌 DON 297.15* 20 249.09 16 烯醇 297.15 20 203.15 10 ESI+ 15-乙酰化脱氧雪 339.19* 18 20 20 腐刀菌烯醇 15-AcDON 339.19 17 8 8 ESI+ 3-乙酰化兑氧雪 3-AcDON 339.12* 17 203.1 13 ESI+ 腐镰刀菌烯醇 339.12 17 231.1 13 黄曲霉毒素G2 AFG2 330.93* 36 244.9 25 ESI+ 330.93 36 313 25 HT-2毒素 HT-2 425.2* 45 245.1 12 ESI+ 425.2 45 263.1 12 黄曲霉毒素B2 AFB2 315.09* 42 259.06 30 ESI+ 315.09 42 287.09 24 329.06* 36 243.1 28 黄曲霉毒素G1 AFG1 329.06 36 311.1 20 ESI+ 黄曲霉毒素B1 AFB1 313.07* 37 241.1 35 313.07 37 285 20 ESI+ T2-毒素 T2 484.26* 15 185.12 17 484.26 15 305.17 15 ESI+ 玉米赤霉烯酮 ZEN 319.15* 17 187.06 19 ESI+ 319.15 17 283.13 11 杂色曲霉素 ST 325.09* 33 281.08 31 ESI+ 325.09 33 310.06 25 赭曲霉毒素A OTA 404.12* 21 239.04 27 ESI+ 404.12 21 358.12 13 *为定量离子 实验结果 基质匹配校准曲线和基质效应 每种化合物使用空白基质配置标准曲线，在0.1pg/L-5pg/L范围内6个不同浓度具有良好的线性关系，相关系数R²>0.99，基质效应见表2。 英文缩写 面粉基质效应 玉米基质效应 15-DON 17% 23% 3-DON 62% 59% AFB1 17% 11% AFB2 10% 15% AFG1 42% 55% AFG2 16% + DON 49% 77% HT-2 Toxin 52% 37% OTA 56% 55% ST 42% 70% T-2 Toxin 68% 63% ZEN 64% 68% +为该目标物为阳性 表2，玉米和面粉样品的基质效应。 方法回收率和稳定性 使用面粉和玉米样品进行添加回收实验。三个不同的添加浓度分别为0.4ug/kg、1pg/kg、5 pg/kg(以黄曲霉AFG1计)，每个添加浓度平行三次重复测定，平均回收率及RSD 结果见表3。 中文名称 英文缩写 保留时间 添加浓农 pg/kg 玉米回收率%(n=3) 面粉回收率 %(n=3) 0.4 69.0 120.3 黄曲霉毒素B1 AFTB1 5.66 1.0 94.8 94.7 5.0 83.1 102.7 0.10 85.0 93.0 黄曲霉毒素B2 AFT B2 5.37 0.25 81.4 99.1 1.25 99.4 101.9 0.4 110.8 103.0 黄曲霉毒素G1 AFT G1 5.38 1.0 80.8 88.5 5.0 92.5 95.6 0.10 104.3 黄曲霉毒素G2 AFT G2 5.06 0.25 88.6 104.3 1.25 100.7 107.4 40.0 98.3 98.0 15-乙酰化脱氧雪腐廉刀菌 烯醇 15-DON 3.21 100.0 90.3 96.4 500.0 100.6 84.7 40.0 75.0 95.3 3-乙酰化脱氧雪腐廉刀菌 3-DON 3.33 100.0 88.3 100.8 烯醇 500.0 82.3 107.4 40 68.8 + 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 1.58 100 64.7 + 500 92.4 100.2 4 89.3 93.3 HT-2毒素 HT-2 Toxin 5.22 10 88.7 99.1 50 102.1 100.9 表3.面粉和玉米样品回收率及RSD结果。(未完见下页) °熟智 90828 (NOOE)DI1 99108 +SS33Ssjjeu l922乙Z乙 0979770079L 09gluuureyo z jo WW：01 0089LL09 9 001 919099 979009959099979009 911 gez1'l 9Z1+S3 sjauueyo zjo WW：LL00108 9LL91092 971 00L 919-001 90861 099 979 009929909997'900J9 9L 09t 9Z1009298 001DE9LZ ( upxo 1Z-1 091H)DI 1 92+S3 sjeuueyo zZJOWWZI0089LL09L 971 001IL 919099929009 99 09ggzg 00919 0E9L70979770092109igi..921 +S3 sjeuueuo zjo WW-EI Z'98 1'69 6Zt 28'9 N3Z 919 Z'98 28'9 N3Z 鲁华米王 8'09 0'lS 9't6 Z'09 Z 91'9 UIXOLZ-1 鲁-71 8'98 0'69 91'9 UIXOLZ-1 鲁-71 8'88 9'89 ttL IS ’甲半 8'98 Z'6L 629 6'88 8'79 8'8Z 99'2 ttL IS ’甲半 LZ9 981 t'0 8'98 629 6y 但阳思 号中 6'98 LLt /6rl104￥ 99'2 VIO V甲 Z'tL 8'6t t'0 (E=U)% (E=U)% 6y 率回 率外回米王 /6rl 104￥ 但阳思 号中 化合物 标准方法LOQ 本方法LOQ 限量值 (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg) 15-DON 20 40 NA 3-DON 20 40 NA 5(小麦) AFB1 0.1 0.4 10(大米) 20(玉米) AFB2 0.1 0.1 NA AFG1 0.1 0.4 NA AFG2 0.1 0.1 NA DON 20 40 1000 HT-2 Toxin NA 4 NA OTA 3 0.4 5 ST 2 4 NA T-2 Toxin 无LCMS方法 LC方法：33 2 NA ZEN LC方法： 17 10 60 注：残留限量参考GB2761-2017，NA表示“无要求”表4.方法LOQ与限量的比较。 净化效果 图2为Oasis° PRiME小柱去除磷脂的效率的比较色谱图；显示了使用Oasis°PRiME小柱成功去除了95%以上的磷脂和80%以上的总脂肪。 图2.使用Oasis°PRiME HLB通过式净化与直接进样的磷脂残留比较。 ( 结论 ) ( 采用OasisPRiME HLB小柱的简单通过式净化方案能够去除提取液中80%以上的总脂肪和95%以上的磷脂，同时使用混合吸附剂的dSPE净化管能有效去除提取液中的极性杂质，保证最小的基质效应。 ) ( 本实验尝试了多款色谱柱，最终选择使用能够有效分离12种真菌毒素，尤其是同分异构体3-乙酰化脱氧 雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的ACQUITY UPLCCSH Fluoro-Phenyl色谱柱。 ) 本方法为LCMSMS测定，其中黄曲霉毒素B1(面粉限量5 ng/g玉米限量20 ng/g)在5 ng/g添加浓度下玉米和面粉的回收率分别为83.1%和102.7%； OTA在限量浓度下，玉米和面粉的回收率分别为67.9%和85.8%； ZEN(限量为60ng/g)在125 ng/g的添加浓度下玉米和面粉的回收率分别为47.9%和69.1%；DON(限量为1000ng/g)在500 ng/g的的添加浓度下玉米和面粉的回收率分别为92.4%和100.2%。 ( 本方法使用基质匹配标准曲线进行定量，因伏马毒素没有找到纯阴性样品，所以回收率数据和和方法定量限无法计算，因此未在此应用中列出。 ) 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-61562666 广州：020-28296555 成都：028-67653588 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676WWW.Waters.com Oasis PRiME HLB-DisQuE QuEChERS净化及UPLC-MS/MS测定谷物中多真菌毒素 Oasis PRiME HLB-DisQuE QuEChERS净化及UPLC-MS/MS测定谷物中多真菌毒素 使用Oasis PRiME HLB小柱进行通过式净化以去除脂肪和磷脂；通过dSPE(分散SPE)净化去除残留的糖类和其它极性物质。应用上述净化方案可以得到满意的回收率。