抗体药物偶联物中药物/抗体比率检测方案(液相色谱仪)

Agilent Technologies 通过表征药物/抗体比率分析抗体药物偶联物 Agilent 1290 Infinity 二元液相色谱系统与 Agilent 6550iFunnel Q-TOF联用 应用简报生物制药 作者 前言 Ravindra Gudihal 和 Jing Chen 安捷伦科技公司 抗体药物偶联物 (ADC) 是通过赖氨酸或半胱氨酸残基共价结合细胞毒性药物的单克隆抗体(图1)。抗体通过结合疾病状态(如癌症)相关细胞表面的表位，可使给药具有特异性。ADC 到达其靶标后即释放出结合的药物，以在局部创造一个高浓度的细胞毒性药物环环。ADC具备提高药效并降低副作用的潜力，因此其市场份额逐渐增加。偶联化学的特性决定了ADC 本质上是载药量不同的抗体混合物。由于药物/抗体比率(DAR) 能够显著影响 ADC 效果，因此 DAR 是衡量 ADC 质量的重要属性；低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学产生负面影响。本研究描述了使用先进液相色谱/质谱联用技术与简单易用的数据分析软件测定完整/还原态赖氨酸偶联 ADC 的 DAR. 图1.ADC示意图 Agilent Technologies 实验部分 材料 PNGase F 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis，MO)。快速 PNGase F 购自New EnglandBiolabs (Ipswich， MA)。其余全部化学品均购自 Sigma-Aldrich (St. Louis，MO)。 工作流程 对 ADC 及其亚基的表征工作流程如以下图2所示。该工作流程包括将糖基化和去糖基化ADC 制备为完整和还原态形式， 以及使用 Agilent 1290 Infinity LC 与 Agilent 6550iFunnel Q-TOF LC/MS 系统联用进行样品分析。对所得质谱图进行解卷积，并使用Agilent MassHunter BioConfirm 软件和安捷伦 DAR计算器计算DAR， 该软件仅需极少用户输入即可快速、轻松完成所有 DAR 峰的积分，并能报告最终 DAR 值。 样品前处理 用去离子 (DI)水将冻干 ADC 复溶至5mg/mL后分装，使用前置于-80℃下储存。 分析完整 ADC时，采用0.1%甲酸水溶液将ADC 复溶并稀释至1mg/mL， 在 LC/MS分析前即用即配。完整 mAb 的去糖基化方法是将溶于20 mM Tris-HCI缓冲液 (pH 8.2)中的1pL 50单位/pL PNGase F (Sigma-Aldrich) 加入 100 pL ADC (100 pg) 中，然后在37°℃下过夜温育。取5pL完整 ADC进行LC/MS分析。 在还原态 ADC 的分析中， ADC 的还原方法是将10pl 新鲜配制的二硫苏糖醇 (DTT)(35mM)以及20 pL 10 mM Tris 缓冲液(pH=7.5)加入一份 5 pL (5 pg) 的 ADC 中，然后在 50°℃ 下温育10 min。在还原态去糖基化 ADC 的分析中， ADC 的去糖基化方法是将 10 pL 新鲜配制的 DTT (35 mM)和20 pL PNGase F试剂(原液稀释40倍， 购 自 New England Biolabs) 溶于10 mM Tris缓冲液(pH=7.5)中，再将这一混合物加入一份5 pL (5 pg) 的 ADC 中， 然后在 50℃下温育 10 min。每种样品的 LC/MS 分析进样量为1pg。 LC/MS 分析 仪器 LC/MS系统 ( Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统包括： ) ( · Agilent 1290 Infinity 二元泵 G4220A ) ( Agilent 1290 Infinity 柱温箱 G1316C ) ( · Agilent 1290 Infinity 进样器 G4226A ) ( Agilent 129 0 Infinity 馏分收集器/ 自动进井器柱温箱 G1330B ) ( 配备安捷伦喷射喷离子源的 Agilent 6550iFunnel Q-TOF LC/MS 系统 ) LC/MS 参数 参数 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统 完整 还原态 色谱柱 Agilent Poroshell 300SB-C8 色谱柱， Agilent PLRP-S 1000A 2.1×75 mm，5 pm (部件号660750-906) 2.1×150 mm，8 pm (PL1912-3802) 样品恒温箱 5°C 5°C 流动相A 含0.1%甲酸的水溶液 含0.1%甲酸的水溶液 流动相B 70%异丙醇/20%乙腈/ 99.9%乙腈/0.1%甲酸 10%水，含0.1%甲酸 梯度(分段) 0min→15%B 0 min → 20% B 4 min→20%B 5 min → 20% B 5 min → 75%B 6 min→75% B 10 min →100% B 10 min→ 90% B 10.1 min→ 15% B 后运行时间 4 min 0 min 柱温 60 C 85°C 流速 0.4 mL/min 0.4 mL/min 参数 Agilent 6550 Q-TOF LC/MS 系统 完整 还原态 离子模式 正离子模式 正离子模式 离子源 安捷伦双喷射流 安捷伦双喷射流 干燥气温度 290°C 290°C 干燥气流速 14 L/min 14 L/min 鞘气温度 400°C 400°C 鞘气流速 12 L/min 12 L/min 雾化器 45 psi 40 psi 毛细管电压 5500V 4500V 喷嘴电压 2000 V 1500V 碎裂电压 400V 250 V 0ct RF Vpp 750 V 750 V 采集参数 数据在2GHz 下采集， 仅MS 模式， 数据在高(10000 m/Z)质量数范围下采集， MS模式 质量数范围为2000-5000 m/z 2 GHz， 仅MS模式，质量数范围为 800-4000m/z 结果与讨论 完整 ADC分析 图3所示为完整 ADC 和去糖基基完整 ADC的LC/MS分析结果。使用异丙醇/乙腈/水在 Agilent Poroshell 300SB-C8 色谱柱中得到了峰宽较窄的总离子流色谱图(图A和图D)。图3还显示了完整ADC 及其去糖基化形式的电荷态分布范围(图B和图E)。解卷积质谱图如图C所示。 完整质谱结果表明，所研究的 ADC 质谱图由于糖基化形式与载药量不同而在不同 ADC 之间具有异质性。正是这种异质性使完整ADC的解卷积质谱图变得非常复杂(图3C)。为简化解卷积质谱图而对 ADC 进行了去糖基化。去糖基化 ADC 质谱图中的电荷态之间实现了良好分离，这表明 ADC 在去除糖基化后仅保留了共价结合的药物分子(图3F)。 解卷积质谱图则显示出了8种主要的药物连接类型(图3F)。 DAR 计算由安捷伦 DAR计算器完成，该软件能够将峰积分自动结合，仅需极少用户干预即可完成 DAR 计算。图4显示去糖基化 ADC 的 DAR计算器界面。 DAR 计算器 从 BioConfirm 软件中导入解卷积质谱图 自动识别 DAR 值不同的峰 计算每种 DAR 的相对峰面积 计算平均 DAR 以及 报告结果 通过简单的用户界面可轻松实现目标待分析峰的手动调节。DAR 计算器使用以下公式： 采用每个峰的相对峰面积(%)以及解卷积质谱图中的相应载药量对 DAR 值进行计算。将相对峰面积(%)与相应载药量相乘得到加权峰百分比，这一百分比可用于衡量每一载药种类对 DAR的贡献(图4)。手动计算的DAR 与 DAR 计算器算出的 DAR 完全一致，因此证明软件具有可靠性。图5显示采用DAR计算器得出的完整 ADC 的 DAR计算结果，此结果难以通过手动解析得出。 DAR计算器是一种用于复杂 ADC 样品 DAR解析和计算的实用工具。 图3.完整糖基化 ADC (图A、B、C)和完整去糖基化 ADC (图D、E、F) 的总离子流色谱图(TIC)、质谱图与解卷积质谱图 图4.使用安捷伦 DAR 计算器得出的去糖基化 ADC 的 DAR计算结果。 DAR 值3.5显示于解卷积质谱图的右上角 图5.使用安捷伦 DAR 计算器得出的完整糖基化 ADC 的 DAR 计算结果。 DAR 值3.6显示于解卷积质谱图的右上角 还原态 ADC分析 图6显示了还原态糖基化和还原态去糖基化ADC 的 LC/MS分析结果。还原态 ADC 包括轻链和重链药物偶联物，其中轻链 DO最先洗脱，而重链D4最后洗脱(图6A和E)。质量数范围为600-3500(图6B和F)。解卷积后分离出了 DO、D1、D2和D3四种轻链以及 D0、D1、D2、D3和D4五种重链(图6C、D、G和H)。去糖基化简化重链质谱图后仅保留了载药量不同的去糖基化 ADC 的一种主要形式，因此各峰的信号强度更高(图6D和H)。由于轻链未经N-糖基化，因此去糖基化不会影响轻链相关药物偶联物的解卷积质谱图(图6C和G)。 导出的糖基化和去糖基化 ADC 的轻链和重链解卷积质谱图随后将加载至 DAR 计算器以对峰进行标记和积分。软件将根据报告的合并 DAR 比率分别计算重链和轻链的 DAR比率。 合并DAR=2×(重链 DAR +轻链 DAR) 图7A和B 显示由 DAR 计算器生成的代表性报告，其中包括标注的解卷积质谱图、轻链和重链的各自DAR 比率、合并DAR 比率，显示理论与观测质量数的表格、峰面积，此外还报告了不同载药量 ADC 的峰面积百分比。表1显示载药量不同的还原态和去糖基化 ADC 的理论和观测质量数、峰面积以及峰面积百分比。 图6.还原态糖基化 ADC (图A-D)和还原态去糖基化 ADC (图E-H) 轻链和重链的 TIC、质谱图与解卷积质谱图 DAR Report Page 1 of 2 Agilent Techmologies 图7A. 安捷伦 DAR 计算器得出的还原态糖基化 ADC 报告(第1页) 图7B. 安捷伦 DAR计算器得出的还原态糖基化 ADC报告(第2页) 结论 采用 Agilent 1290 Infinity 液普色谱系统结合Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 与安捷伦液相色谱柱的 ADC 反相色谱分析可凭借其优异性能广泛用于高重现地生成完整和还原态ADC 的精确 DAR 值。 Agilent MassHunter BioConfirm 软件和DAR 计算器可共同实现高效的数据提取与解卷积，并能轻松直观地计算并报告完整与还原态ADC 的 DAR 值。 ( 参考文献 ) ( 1. Chari， R . V .； Miller， M. L . ； Widdison， W. C. Antibody-drug conjugates： an emerging concept i n cancer therapy.Angew Chem. Int. Ed. Engl.， 2014， 53(15)， pp 3796-827 ) 2. Perez， H.L.， et al.， Antibody-drugconjugates： current status and futuredirections. Drug Discov Today， 2014.19(7)： p.869-81 理论质量数 观测质量数 DAR峰 (Da) (Da) 峰面积 峰面积百分比 重链结果 0 49148.65 49149.9 1.39E+006 31.87 1 50106.15 50107.7 1.41E+006 32.34 2 51063.65 51065.5 1.04E+006 24.00 3 52021.15 52023 4.29E+005 9.86 4 52978.65 52980.9 8.43E+004 1.94 轻链结果 0 23439.1 23439.3 1.70E+006 70.48 1 24396.6 24396.8 4.57E+005 18.91 2 25354.1 25354.2 2.19E+005 9.08 3 26311.6 26311.2 3.71E+004 1.53 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) www.agilent.com/chem/bioconfirm 联系我们： 仅限研究使用。不可用作诊断方法。 LSCA-China 800@agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2015 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn 2015年10月8日， 中国出版 5991-6242CHCN Agilent Technologies 前言抗体药物偶联物 (ADC) 是通过赖氨酸或半胱氨酸残基共价结合细胞毒性药物的单克隆抗体。抗体通过结合疾病状态（如癌症）相关细胞表面的表位，可使给药具有特异性。ADC 到达其靶标后即释放出结合的药物，以在局部创造一个高浓度的细胞毒性药物环境。ADC 具备提高药效并降低副作用的潜力，因此其市场份额逐渐增加。偶联化学的特性决定了 ADC 本质上是载药量不同的抗体混合物。由于药物/抗体比率 (DAR) 能够显著影响 ADC 效果，因此 DAR 是衡量 ADC 质量的重要属性；低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学产生负面影响。本研究描述了使用先进液相色谱/质谱联用技术与简单易用的数据分析软件测定完整/还原态赖氨酸偶联 ADC 的 DAR。结论采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统结合 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 与安捷伦液相色谱柱的 ADC 反相色谱分析可凭借其优异性能广泛用于高重现地生成完整和还原态 ADC 的精确 DAR 值。Agilent MassHunter BioConfirm 软件和 DAR 计算器可共同实现高效的数据提取与解卷积，并能轻松直观地计算并报告完整与还原态 ADC 的 DAR 值。