发酵饮品中黄酮和酚酸检测方案(超临界色谱)

SSL-CA14-659Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-332 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱法测定发酵饮品中20种黄酮和酚酸 LCMSMS-332 摘要：：2本实验使用岛津三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 建立了发酵饮品中20种黄酮和酚酸类物质的检测方法。本法线性范围宽，相关系数R大于0.99，各标准点准确度在80~114%之间。在100 pg/L(橙皮苷500 ug/L，异鼠李素25 ug/L) 加标量下考察萃取回收率和重复性，各组分定量结果的相对标准偏差在1.7~12.7%之间，回收率在84.8~121.9%，可以满足定量分析的需求。本法成功用于多份发酵饮品的含量检测。 关键词： LCMS发酵饮品黄酮酚酸 发酵饮品是以果汁、蔬菜汁为主要原料，经乳酸菌或酵母菌发酵后，再经调香调味的一类现代发酵食品。具有调节肠道菌群、调节免疫系统、抗氧化等作用。果蔬发酵汁中含有很多活性物质，如多酚类、黄酮类、生物碱类、多糖类以及甾醇类化合物。多酚类物质，如对羟基苯甲酸、香草酸、琥珀酸具有维持果蔬色泽、抗菌、 抗氧化的作用。乳酸菌发酵过程中，果蔬中多酚和黄酮类之间会互相转化，改善果蔬汁的口感和功效。 本文使用岛津三重四极杆质谱仪 LCMS-8050建立了发酵饮品中的黄酮和酚酸类物质的检测方法，在发酵饮品营养成分测定，及发酵工艺优化领域具有广阔的应用前景。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统，包括LC-30ADx2(输液泵)， SIL-30AC( 自动进样器)， CTO-30A(柱温箱)， CBM-20A(系统控制器)， DGU-20A，(在线脱气机)，LCMS-8050(三重四极杆质谱仪)和 LabSolutions Ver 5.89。 1.2样品信息 化合物信息见表1。 标准溶液配制方法如下：分别别取橙皮苷、川川皮苷、桔红素、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、芦丁、金丝桃苷、香豆酸、芥子酸、阿魏酸、皮苷、木犀草素、草皮素、芹菜素、柚皮素 10 mg，异鼠李素2.5 mg， 用甲醇超声溶解定容至10mL，配制成单一标准溶液。上述20种单一标准溶液各取 100pL，甲醇定容至10 mL 配制成 10 mg/L 混合标准溶液母液(异鼠李素为2.5 mg/L)。再用甲醇对比稀释成 3.91、7.81、15.62、31.25、62.5、125、250、500、1000ug/L的混合工作溶液(异鼠李素为0.98、1.95、3.91、7.81、15.62、31.25、62.5、125、250 ug/L)。 实际样品制备方法：桔皮汁和桔肉汁用甲醇稀释100倍，过滤后直接进样。柠檬片和普洱样品分别别取1g，加10mL甲醇超声30分钟，取1mL上述溶液用甲醇稀释至10 mL， 过滤后直接进样。 表1l化合物信息 No. 名称 英文名 CAS# 分子式 橙皮苷 Hesperidin 520-26-3 C28H34O15 2 川陈皮苷 Nobiletin 478-01-3 C21H22O； 3 桔红素 Tangeretin 481-53-8 C20H20O7 4 原儿茶酸 3，4-Dihydroxybenzoic acid 99-50-3 C7H6O4 5 绿原酸 Chlorogenic acid 327-97-9 C16H18O9 6 儿茶素 Catechin hydrate 18829-70-4 C15H16O7 7 表儿茶素 Epicatechin 490-46-0 C15H16O7 8 邻苯二甲酸 Phthalic acid 88-99-3 CH6O4 9 对羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid 99-96-7 C7H6O3 10 芦丁 Rutin 153-18-4 C27H30O16 11 金丝桃苷 Hyperoside 482-36-0 C21H20O12 12 香豆酸 Coumalic acid 500-05-0 C6H4O4 13 芥子酸 Sinapinic acid 530-59-6 C1H12Os 14 阿魏酸 Ferulic Acid 1135-24-6 C10H10O4 15 梅皮苷 Quercitrin 522-12-3 C21H20O11 16 木犀草素 Luteolin 491-70-3 C15H10O6 17 桷皮素 Quercetin 117-39-5 C15H10O7 18 芹菜素 Apigenin 520-36-5 C15H10O5 19 柚皮素 Naringenin 480-41-1 C15H12O5 120 异鼠李素 Isorhamnetin 480-19-3 C16H12O7 1.3分析条件 液相色谱条件 流动相：A相-0.1%甲酸、1mM乙酸铵水溶液，B相-乙腈 柱温：40℃ 流速：0.2 mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，时间程序见表2。 色谱柱： Capcell PAK ADME2.1 mm I.D.x 50 mm L.， 2 pm 进样体积：： 1pL 表2梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 6.00 Pumps B.Conc 50 8.00 Pumps B.Conc 80 8.10 Pumps B.Conc 100 10.00 Pumps B.Conc 100 10.10 Pumps B.Conc 20 14.00 Controller Stop 质谱条件： 离子源： ESI 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0L/min 接口电压：4kV 干燥气流速：10.0L/min加热气流速：10.0L/min DL温度：250℃ 接口温度：300℃ 表3MRM参数 *表示定量离子注：芥子酸只有一个离子对 结果与讨论 2.1 LCMS 色谱图 对橙皮苷等20种目标物进行色谱分离优化，在 Capcell PAK ADME 色谱柱上各组分保留适中，分离良好。图1为31.2 ug/L(异鼠李素 7.8 ug/L) 混标色谱图。 图11]LCMS标样检测色谱图(1、橙皮苷；2、川陈皮苷；3、桔红素；4、原儿茶酸；5、绿原酸；6、儿茶素；7、表儿茶素；8、邻苯二甲酸；9、对羟基苯甲酸；10、芦丁；11、金丝桃丝；12、香豆酸；13、芥子酸；14、阿魏酸；15、槲皮苷；16、木犀草素；17、檞皮素；18、芹菜素；19、柚皮素；20、异鼠李素。1~19号组分浓度为31.2 pg/L， 异鼠李素7.8 ug/L)； 2.2线性范围 按照1.2所述方法配制系列工作溶液，按照1.3所述分析条件进行测定。以目标峰的浓度为横坐标，以目标峰面积为纵坐标，外标法制作工作曲线，各组分线性回归方程及相关系数见表4。实验结果表明各组分在考察范围内线性关系良好，线性相关系数R大于0.99，各标准点准确度在 80~114%之间。使用 LabSolutions 软件， ASTM 法计算最低标准样品的信噪比，由信噪比计算结果计算得到目标组分定量限(LOQ， S/N=10)在 1~15 pg/L 之间。 表4各组分标准曲线及相关系数 No. 名称 线性范围 线性方程 相关系数 Accuracy(%) LOQ (ug/L) 1 (ug/L) 橙皮苷 7.8-1000 Y=(641.181)X 0.9990 83-103 7 2 川陈皮苷 3.9-500 Y=(136187)X 0.9986 85-103 3 3 桔红素 7.8-250 Y=(243871)X 0.9999 99-114 7 4 原儿茶酸 15.6-1000 Y=(1124.12)X 0.9990 94-102 15 5 绿原酸 7.8-1000 Y=(1631.60)X 0.9985 82-103 7 6 儿茶素 15.6-1000 Y=(216.486)X 0.9997 81-102 15 7 表儿茶素 7.8-1000 Y=(174.216)X 0.9994 85-103 7 8 邻苯二甲酸 15.6-1000 Y=(897.326)X 0.9992 83-103 15 9 对羟基苯甲酸 15.6-1000 Y=(997.752)X 0.9998 81-104 15 10 芦丁 7.8-1000 Y=(1268.15)X 0.9996 80-101 7 11 金丝桃苷 7.8-1000 Y=(1771.81)X 0.9999 88-101 7 12 香豆酸 7.8-1000 Y=(2502.40)X 0.9998 80-102 7 13 芥子酸 15.6-1000 Y=(183.645)X 0.9997 80-102 15 14 阿魏酸 15.6-1000 Y=(480.072)X 0.9991 88-102 15 15 槲皮苷 7.8-1000 Y=(1995.78)X 0.9995 81-101 7 16 木犀草素 7.8-1000 Y=(3938.24)X 0.9995 81-102 7 17 槲皮素 15.6-1000 Y=(2094.55)X 0.9987 88-103 15 18 芹菜素 3.9-1000 Y=(5348.28)X 0.9997 89-103 2 19 柚皮素 0.98-1000 Y=(3652.61)X 0.9995 87-105 20 异鼠李素 1.95-250 Y=(23966.4)X 0.9995 87-103 2 2.3重复性和回收率考察 平行制备六份桔肉汁样品，在100 ug/L(橙皮苷 500 ug/L， 异鼠李素 25 ug/L) 加标量下考察萃取回收率和重复性，结果如表5所示。实验结果表明，表组分定量结果的相对标准偏差在1.7~12.7%之间，回收率在 84.8~121.9%，可以满足定量分析的需求。 表5 各组分的萃取重复性考察结果(n=6) No. 名称 样品测试 加标值 加标结果 值(ug/L) (ug/L) 加标样平均实测值(ug/L) CV(%) 回收率(%) 橙皮苷 665 500 1126 3.6 84.8-103.8 川陈皮苷 - 100 95.4 2.5 94.0-97.6 桔红素 - 100 105.0 1.7 103.9-105.8 4 原儿茶酸 56.7 100 164.3 4.7 95.8-116.7 绿原酸 - 100 115.3 9.7 95.1-120.8 6 儿茶素 - 100 103.3 10.6 89.3-118.3 7 表儿茶素 - 100 105.1 12.7 88.0-121.9 邻苯二甲酸 2.1 100 106.7 2.3 101.5-107.9 9 对羟基苯甲酸 8.7 100 115.6 5.5 96.5-114.5 10 芦丁 69 100 177.3 2.5 101.7-111.9 11 金丝桃苷 - 100 117.6 3.8 109.8-120.8 12 香豆酸 - 100 116.1 3.7 111.0-120.8 13 芥子酸 - 100 107.9 10.8 88.7-121.7 14 阿魏酸 - 100 100.5 7.5 89.1-108.3 15 梅皮苷 - 100 103.2 4.3 98.6-110.9 16 木犀草素 - 100 110.9 3.5 107.0-115.3 17 榭皮素 一 100 110.1 6.1 104.3-120.6 18 芹菜素 - 100 112.5 3.6 108.0-116.9 19 柚皮素 45.1 100 151.0 3.8 102.6-109.8 20 异鼠李素 25 26.9 5.3 98.5-113.9 2.4实际样品检测 使用本文开发的方法对多份发酵饮品进行含量测定。样品中各目标组分的含量测定结果见表6，典型色谱图见图2。 图29实际样品检测色谱图 表6实际样品中各组分含量测定结果(mg/L， n=2) No. 名称 桔皮汁 桔肉汁 柠檬汁 普洱 橙皮苷 39.0 66.5 246 川陈皮苷 桔红素 原儿茶酸 0.633 5.67 0.676 绿原酸 1.86 6 儿茶素 9.29 7 表儿茶素 260 邻苯二甲酸 0.209 对羟基苯甲酸 0.885 0.870 10 芦丁 7.25 6.90 5.87 8.46 11 金丝桃苷 0.157 3.98 12 香豆酸 3.62 0.239 13 芥子酸 1.15 14 阿魏酸 8.00 0.265 15 皮苷 16 木犀草素 17 梅皮素 18 芹菜素 19 柚皮素 0.0119 4.51 20 异鼠李素 结论 本文使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 检测发酵饮品中20种黄酮和酚酸类营养成分。该方法在发酵饮品营养成分测定领域具有广阔的应用前景。 ( 岛津全球应用技术开发支持中心 ) 发酵饮品是以果汁、蔬菜汁为主要原料，经乳酸菌或酵母菌发酵后，再经调香调味的一类现代发酵食品。果蔬发酵汁中含有很多活性物质，如多酚类、黄酮类、生物碱类、多糖类以及甾醇类化合物。本文使用岛津三重四极杆质谱仪LCMS-8050建立了发酵饮品中的黄酮和酚酸类物质的检测方法，在发酵饮品营养成分测定，及发酵工艺优化领域具有广阔的应用前景。