牛奶中螺吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-655Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-330 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱串联质谱检测牛奶中林可胺类和大环内酯类抗生素残留 LCMSMS-330 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用测定牛奶中林可胺类和大环内酯类抗生素(螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素)残留的方法。采用外标法快速、准确地测定6种抗生素，其线性良好，相关系数均大于0.9995；配制0.5、1和5 ug/L 的混合标准溶液进行精密度测试，实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别在 0.03~0.14%和0.42~5.35%之间，仪器精密度良好；6种物质的检出限在0.0003~0.0064 ug/L之间，定量限0.0008~0.0083 ug/L之间；样品加标回收率在74.3~113.8%间。 关键词：牛奶大环内酯类林可霉素类超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 吡利霉素属于最新研制的林可霉素类抗菌药物，常作为奶牛乳房注入剂使用。临床试验表明该药对金黄色葡萄球菌、无乳球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等致的临床及亚临床型乳腺炎效果明显。大环内酯类药物具有抗革兰氏阳性菌和抗支原体活性，兽医临床常见的有红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素等。动物源食品中林可胺类药物残留可引起肾功能障碍和革兰氏阳性菌的耐药性增加；大环内酯类药物残留可引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散。因此，欧盟和我国都对动物源食品中这两类药物的最大残留限量做了严格规定。美国和欧盟规定吡利霉素在上市牛奶中的最大残留限量(MRL)为100 ug/L。欧盟规定牛奶中泰乐 菌素、替米卡星的最高残留限量为 50ug/kg，红霉素为40pg/kg。 本文参考国标《GB/T 22988-2008牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，用乙腈提取牛奶中的目标物， HLB 固相萃取柱净化，建立了超高效液相色谱串联质谱检测牛奶中林可胺类和大环内酯类抗生素残留量的方法，方法的检出限小于为0.006 ug/L，远远低于，国内外有关法规的要求，可为牛奶中林可胺类及大环内酯类药物残留的监督检验和国内的残留监控提供技术支持。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为 LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：Inertsil Ph-3 (2.1 mm I.D.×150 mm L.，柱温：40℃3 um)进样体体： 10pL流动相： A-0.1%甲酸水溶液； B-甲醇洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为15%，流速：0.4 mL/min时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 80 8.00 Pumps Pump B Conc. 80 8.01 Pumps Pump B Conc 15 12.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8050 接口温度：350℃ 离子源： ESI(+) 脱溶剂管温度：200℃ 雾化气：氮气2.0L/min 加热模块温度：400℃ 加热气：氮气10L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气：氮气10L/min MRM参数：见表2 碰撞气：氩气 表2MRM参数 前体 产物 Q1 Pre Q3 Pre 接口电压 编号 名称 英文名 CAS 号 离子 离子 Bias(V) CE(V) Bias(V) (kV) 1 螺旋霉素 Spiramycin 8025-81-8 843.50 174.20* 540.30 -28.0 -28.0 -38.0 -30.0 -17.0 -38.0 1.0 1.5 2 吡利霉素 Pirlimycin 79548-73-5 411.20 112.10* 363.20 -14.0 -14.0 -27.0 -18.0 -20.0 -25.0 1.0 3 竹桃霉素 Oleandomycin 7060-74-4 688.50 158.20* 544.40 -22.0 -22.0 -29.0 -17.0 -29.0 -38.0 0.5 4 替米卡星 Tilmicosin 108050-54-0 869.60 174.20* 156.10 -28.0 -28.0 -46.0 -49.0 -30.0 -15.0 1.0 1.5 5 红霉素 Erythromycin 114-07-8 734.50 158.20* 576.40 -24.0 -24.0 -31.0 -20.0 -28.0 -40.0 174.20* -20.0 -40.0 -17.0 6 泰乐菌素 Tylosin 1401-69-0 916.50 772.40 -20.0 -31.0 -38.0 *表示定量离子 1.3样品制备 1.3.1标准溶液配制： 用甲醇配制1000 mg/L 螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米考星、红霉素和泰乐菌素储备液。取牛奶阴性样品，按1.3.2样品前处理方法，得到空白基质溶液。取混合储备液，用空白基质溶液稀释，得到 0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5ng/mL 和10 ng/mL的混合基质标准校准溶液，上机测定。 1.3.2样品前处理方法： 称取4g牛奶于50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 乙腈振荡提取2 min 后， 3000 r/min 离心10 min， 移取上清液至鸡心瓶中。再用10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。将提取液于45℃下旋转蒸发至约4mL左右，加入2 mL0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)，混匀后，转移至已用3mL甲醇、3mL 水和3mL磷酸盐缓冲溶液活化的 HLB 固相萃取柱(500 mg， 6 mL)上。接着依次用3 mL 水和2 mL甲醇水溶液(甲醇/水=3/7， v/v)淋洗并洗干，最后用6 mL乙腈洗脱。洗脱液在45℃水浴上氮吹至干，用0.1 mol/L 甲酸铵溶液定容至2mL， 涡旋混合后，过0.45um 滤膜供 HPLC-MS/MS 分析。 结果与讨论 2.1标准溶液的 MRM色谱图 0.1 ng/mL 混合标准溶液的 MRM 色谱如图1所示。 图1100.1ng/mL标样的MRM图 2.2线性关系与检出限、定量限 将混合标准工作液，按1.2中的分析条件进牛测定，外标法制作校准曲线，如图2~7所示。根据检出限MDL=3.3 S/N，定量限LOQ=10S/N 计算检出限和定量限，结果如表3所示。 图2吡利霉素标准工作曲线 图3替米卡星标准工作曲线 图4红霉素标准工作曲线 图55泰乐菌素标准工作曲线 图6竹桃霉素标准工作曲线 图7螺旋霉素标准工作曲线 表336种物质的校准曲线参数与检出限、定量限 No. 名称 线性范围 校准曲线 相关系数 准确度 检出限 定量限 (ug/L) R (%) (ug/L) (ug/L) 1 吡利霉素 0.05~10 Y=(366795)X+(7945.78) 0.9999 97.1~114.1 0.0064 0.0021 2 替米考星 0.05~10 Y=(180014)X+(8929.64) 0.9998 86.4~104.4 0.0003 0.0008 3 红霉素 0.05~10 Y=(180014)X+(8929.64) 0.9999 86.3~103.9 0.0005 0.0015 4 泰乐菌素 0.05~10 Y=(63173.3)X+(6049.23) 0.9995 87.5~110.6 0.0014 0.0043 5 竹桃霉素 0.05~10 Y=(289676)X+(14860.8) 0.9999 94.6~103.6 0.0011 0.0034 6 螺旋霉素 0.05~10 Y=(27691.0)X+(1829.53) 0.9997 86.2~113.5 0.0027 0.0083 2.3精密度实验 配制0.5、1和5 mg/L混合标液，重复进样6次。6种目标化合物保保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.03~0.14%和0.42~5.35%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) No. 名称 RSD% (0.05 pg/L) RSD% (0.5 ug/L) RSD% 6 (5 pg/L) R.T Area R.T Area R.T Area 1 吡利霉素 0.10 2.38 0.09 1.25 0.08 0.82 2 替米考星 0.10 3.62 0.08 1.80 0.09 0.42 3 红霉素 0.09 1.46 0.03 1.25 0.07 1.45 4 泰乐菌素 0.10 4.14 0.05 2.67 0.06 1.72 5 竹桃霉素 0.09 1.85 0.06 1.33 0.08 1.52 6 螺旋霉素 0.14 5.35 0.04 2.84 0.09 1.73 2.4基质加标实验 按照1.3.2中样品制备方法，进行加标回收实验，加标含量为0.5和1 ng/g。测试结果显示：牛奶样品的加标回收率在 74.3~113.8%之间；具体结果如表5。 表5力加标样的回收率结果 No. 牛奶样品 加标样 名称 加标浓度 加标回收率 加标浓度 加标回收率 浓度 (ng/g) (ng/g) (%) (ng/g) (%) 1 吡利霉素 N.D 0.5 79.6 1 74.3 2 替米考星 N.D 0.5 98.9 1 104.5 3 红霉素 N.D 0.5 113.8 1 110.5 4 泰乐菌素 N.D 0.5 76.4 1 76.5 5 竹桃霉素 N.D 0.5 107.6 1 96.8 6 螺旋霉素 N.D 0.5 83.6 1 93.8 注： N.D表示未检出； 结论 使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用测定牛奶中林可胺类和大环内酯类抗生素(螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素)残留，线性良好，相关系数均大于 0.9995；牛奶样品加标的回收率在 74.3~113.8%之间；其检出限在 0.0003~0.0064 ug/L 之间，定量限0.0008~0.0083 ug/L；远远低于国内外有关法规的要求，可为牛奶中林可胺类及大环内酯类药物残留的监督检验和国内的残留监控提供技术支持。 ( 岛津全球应用技术开发支持中心 ) 本文用乙腈提取牛奶中的目标物，HLB固相萃取柱净化，建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定牛奶中林可胺类和大环内酯类抗生素（螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素）残留的方法。采用外标法快速、准确地测定6种抗生素，其线性良好，相关系数均大于0.9995；配制0.5、1和5 μg/L的混合标准溶液进行精密度测试，实验结果表明：其保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.03~0.14%和0.42~5.35%之间，仪器精密度良好；6种物质的检出限在0.0003~0.0064 μg/L之间，定量限0.0008~0.0083 μg/L之间；样品加标回收率在74.3~113.8%间。