12 种游离氨基酸中亮氨酸和异亮氨酸检测方案(液相色谱仪)

Agilent InfinityLab Poroshell 120HILIC 1.9 pm 色谱柱对游离氨基酸的 LC/MS分析 应用简报 农业、食品检测、.小分子制药 作者 摘要 Anne Mack安捷伦科技公司 Wilmington， DE， USA 本文采用甲酸铵和乙腈梯度以及 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC 2.1×150 mm， 1.9 pm 色谱柱对12种游离氨基酸进行了 LC/MS 分析。550 bar 下，同质异位亮氨酸和异亮氨酸在11分钟内达到基线分离 (Rs=1.9)。 Agilent Technologies 表面多孔颗粒填料液相色谱柱是液相色谱分析中的常用工具。与对应的全多孔颗粒色谱柱相比，表面多孔颗粒填料色谱柱能够在较低压力下获得较高柱效[1]。这主要是因为色谱柱中的填料具有更短的传质距离和更窄的粒径分布[2]。表面多孔颗粒填料的当前趋势是通过不断缩小填料粒径实现柱效的进一步提高。较高的柱效可通过提高分离度和灵敏度来加快分析速度或改善分析结果。 本应用简报证明了 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC1.9 pm 色谱柱的 UHPLC 性能及其在 LC/MS 中对12种游离氨基酸的分析能力(其中包括一对同质异位素的基线分离)。 实验采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱与 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统。将系统由标准配置改良为低系统体积和低扩散的系统。表1列出了本实验中所用的详细配置和安捷伦液相色谱柱。表2列出了液相色谱方法参数，表3列出了质谱参数，表4列出了 MS SIM 参数。 本应用简报中分析的12种氨基酸为混合组分溶液，购自安捷伦(5061-3330)；进样前将样品用乙腈按 1：10进行稀释。甲酸铵及甲酸购自 Sigma-Aldrich。乙腈购自 Honeywell (Burdick and Jackson)。水经过 Milli-Q系统(Millipore) 0.2 pm 滤膜过滤，电阻率为18MQ。 35pL溶剂混合器： Jet Weaver， 35 pL/100 pL (G4220-60006) 超低扩散针座组件，用于 Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226-87030) 自动进样器到加热器的不锈钢毛细管，0.075×220 mm， SV/SLV (5067-4784) 螺口盖样品瓶，棕色，带书写签，经认证，2mL， 100/包(5182-0716) 螺口瓶盖，盖色，PTFE/红色硅橡胶隔垫，100/包(5182-0717) 样品瓶内插管，250pL，带聚合物支脚，100/包 (5181-1270) 热交换器，低扩散，1.0pL，长型，朝下 (G1316-80012) InfinityLab Quick Turn 接头 (5067-5966) 色谱柱到质谱离子源的不锈钢毛细管，0.075×340 mm， SV/SLV (5067-4783) 超低扩散最大光强卡套式流通池，10 mm (G4212-60038) 安捷伦喷射流技术 G4220A： B.06.72[0002] G4226A：A.06.54[006] G1316C： A.06.53 [002] G4212A： B.06.72[0002] Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC， 2.1×150 mm， 1.9 pm (693675-901) 参数 流动相A 10 mM 甲酸铵水溶液， pH 3 流动相B 10mM 甲酸铵的乙腈：水 (9：1) 溶液， pH 3 流速 0.4mL/min 梯度 5分钟内B由100%降至95%，在之后的6分钟内B由 95%降至60% 后运行 4 min 进样量 5pL 自动进样器温度 4°C 柱温 15°C 二极管阵列检测器 关闭 色谱柱 Agilent Poroshell 120 HILIC， 2.1×150 mm， 1.9 pm (693675-901) 样品 安捷伦氨基酸标准品， 1 nmol/pL (5061-3330)，用乙腈以1：10稀释 结果与讨论 表3. 质谱方法参数 图1显示了12种游离氨基酸在 InfinityLab Poroshell 120HILIC， 2.1 ×150 mm， 1.9 pm 色谱柱上的分离情况。在LC/MS检测中，基线色谱分离并非所有化合物的必需条件，因为检测器会根据特定的质量碎片对分析物进行分离。然而，存在同质异位化合物时就有必要达到基线色谱分离。如图2所示，亮氨酸和异亮氨酸的色谱分离度是1.9，因此这两种同质异位素可实现良好的积分与定量分析。 质谱离子源参数 干燥气温度 300°C 扫描类型 MS2 SIM 干燥气流量 5 L/min 质量数 见表4 雾化器压力 45 psi 碎裂电压 见表4 鞘气温度 400°C 碰撞池加速器电压 7V 鞘气流速 11 L/min 极性 正 毛细管电压 3500 V 时间间隔1 3.6 min 时间间隔2 6.6 min 表4. MS SIM 方法参数 (按洗脱顺序排列) 分子量 M+H 碎裂电压 (ms) 时间段 L-苯丙氨酸 165.19 166 25 5 L-酪氨酸 181.19 25 5 L-异亮氨酸/亮氨酸131.17 25 L-蛋氨酸 149.21 75 5 L-缬氨酸 117.15 25 5 2 L-苏氨酸 119.12 120 25 5 2 L-丙氨酸 89.09 90 25 5 2 L-丝氨酸 105.09 106 25 5 2 L-脯氨酸 115.13 116 50 5 2 甘氨酸 75.07 76 25 5 2 L-谷氨酸 147.13 148 75 5 2 Agilent Poroshell 120 HILIC， 2.1 ×150 mm， 1.9 pm 色谱柱 ×102 最大压力=550 bar 图1. 12种游离氨基酸在 Agilent Poroshell 120 HILIC 1.9 pm 色谱柱上的分离 ×102 图2.2.同质异位亮氨酸和异亮氨酸在 Agilent Poroshell 120 HILIC 1.9 pm 色谱柱上的分离 结论 参考文献 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1.9 pm 色谱柱可实现游离氨基酸的 LC/MS 分离。这款表面多孔颗粒填料色谱柱的高柱效使这对同质异位素实现了充分的基线分离。 1. A. Gratzfield-Hugsen， E. Naegele.使用 Agilent Poroshell120 色谱柱最大限度提高柱效，安捷伦科技公司应用简报，出版号5990-5602CHCN， 2016 2. V. R. Meyer. Practical High Performance LiquidChromatography. Fourth Edition， p. 34. Wiley (2004) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： www.agilent.com 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 LSCA-China_800@agilent.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 在线询价： @安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年10月19日，中国出版 www.agilent.com/chem/erfq-cn 5991-7541CHCN Agilent Technologies 摘要本文采用甲酸铵和乙腈梯度以及 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC 2.1 × 150 mm，1.9 μm 色谱柱对 12 种游离氨基酸进行了 LC/MS 分析。550 bar 下，同质异位亮氨酸和异亮氨酸在 11 分钟内达到基线分离 (Rs = 1.9)。前言表面多孔颗粒填料液相色谱柱是液相色谱分析中的常用工具。与对应的全多孔颗粒色谱柱相比，表面多孔颗粒填料色谱柱能够在较低压力下获得较高柱效。这主要是因为色谱柱中的填料具有更短的传质距离和更窄的粒径分布。表面多孔颗粒填料的当前趋势是通过不断缩小填料粒径实现柱效的进一步提高。较高的柱效可通过提高分离度和灵敏度来加快分析速度或改善分析结果。本应用简报证明了 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1.9 μm 色谱柱的 UHPLC 性能及其在 LC/MS 中对 12 种游离氨基酸的分析能力（其中包括一对同质异位素的基线分离）。结论使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1.9 μm 色谱柱可实现游离氨基酸的 LC/MS 分离。这款表面多孔颗粒填料色谱柱的高柱效使这对同质异位素实现了充分的基线分离。