混合物中馏分收集与纯化检测方案(液相色谱仪)

0.00 min7.00 min 采用 Agilent 1290 Infinity ll制备型 Open-Bed 馏分收集器基于时间、峰和质量进行馏分收集 技术概述 作者 摘要 Florian Rieck 安捷伦科技公司 Waldbronn， Germany Agilent 1290 Infinity Ⅱl制备型 Open-Bed 馏分收集器为高效灵活地进行馏分收集树立了新标杆。馏分床可单独配备6个容器，容纳8种不同尺寸的馏分管。三个抽屉让您即使在运行期间也能轻松获取已收集的馏分。基于峰和时间的馏分模式已扩展至八种组合模式，能对体积或时间片段进行收集，且包括两种回收收集模式。紫外(UV)和质量选择检测(MSD) 信号的触发组合现包含一个 AND/OR 逻辑算符，为挑战性纯化提供了额外的灵活性。本技术概述将提供馏分模式(包括收集结果)更深层次的介绍以及典型应用示例。 Agilent Technologies 前言 馏分收集是将分析型高效液相色谱(HPLC) 系统转变为纯化系统的关键特征。听起来可能简单，但一般来讲，馏分收集(尤其是制备型纯化)确实存在有挑战性的地方。制备型 HPLC的流速范围为 5-100 mL/min 或以上，生成的馏分体积从不足1mL到高达数十或数百 mL。若要最大程度利用馏分收集器的容量，便需要不同尺寸的收集容器。所收集的馏分需快速处理(重新分析、混合和溶剂蒸发)，因此还需要一个易于操作的馏分床。 ( Agilent 1290 Infinity ll制备型 Open- Bed馏分收集器包含新功能和改进的 功能，可以解决所有这些问题。带有 不同直径(12、16、25、30mm)和长度(100或150mm) )馏分管的馏 分容器经过优化，可容纳8-78 mL 的 馏分。馏分床可单独配备6个容器， 最多可容纳432个单馏分，或最大 5940 mL 的馏分体 积 。三个抽屉将馏分床分隔开，即使在运行期间也能交换整个抽屉。只有当前使用的抽屉处于锁定状态，以防溢液和样品损失。 ) ( 根据所使用的流速，可为最佳设置配备不同内径的管线工具包。与 Agilent 1260 Infinity 馏分收集器一样，1290Infinity Ⅱ制备型 Open-Bed馏分收集 器具有内置延迟传感器，无需更改任何硬件便能精确校准检测器和馏分阀 之间的延迟。 ) 随着硬件的改进，1290 Infinity Ⅱ制备型 Open-Bed 馏分收集器还提供了几种增强型馏分收集模式，将基于峰和基于时间的收集相结合，并包含回收收集。由紫外(UV)和质量选择检测 (MSD)信号组合触发的馏分收集也可通过第三种模式得到扩展，结合了逻辑 AND/OR 连接的优点。本技术概述介绍了 Agilent 1290 Infinity Ⅱl制备型Open-Bed 馏分收集器中可用的不同馏分收集模式，以及功能增强的典型应用。 ( 实验部分 ) ( 仪器 ) ( Agilent 1260 Infinity 制备型纯化系统由以下模块组成： ) ( Agilen t 1260 Infinity 制备泵组合 (G1361A 和 G1391A) ) ( Agilent 1260 Infini t y 四元泵(G1311B)， 用于 MSD 补偿流量 ) ( Agilent 1260 Infinity 双定量环自 动进样器(G2258A)， 配备50 pL (低)和5mL(高)进样环 ) ( Agilent 1260 Infinity 二极管阵列 检测器(G1315C)， 配备 3 mm 制备型流通池(选件#22) ) ( Agilent 1290 Infini t y Ⅱl制备型Open-Bed 馏分收集器 (G7159B)， 配备使用16×150 mm (G9312-60129)和12× 1 00 mm(G9321-60045)管的馏分容器 ) ( 安捷伦主动式分流器 (G1968F)， 通过 Agilent 1200 Infinity 通用接 口盒Ⅱ (G1390B) 连接 ) ( 采用安捷伦喷射流技术的Agilent6150单四极杆液质联用系统 (G6150B) ) ( 进行馏分重新分析时， Agilent 1260Infinity ll 二元液相色谱仪采用以下 配置： ) ( Agilent 1260 Infinity ll二元泵 (G7112B) ) ( Agilent 1260 Infinity Ⅱl样品瓶 进样器(G7129A) ) ( Agilent 1260 Infinity ll二极管 阵列检测器 (G7115A) ， 配备一个10mm 标准流通池 (G1315- 60022) ) 色谱柱 制备柱 ( Agilent ZORBAX SB-C18 PrepHT 21.2×100 mm，5 p m (部件号 880966-122.01) ) ( 分析柱 ) ( Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×50mm， 5um(部件号846975-902) ) ( 软 件 ) ( 分析系统由 Ag i lent OpenLAB CDS ChemStation 版控制，用于液相色谱 禾液质联用系统，版本 C.01.07 SR1 [110]。制备型系统由相同的软件控 制，版 本 C.01.07 SR2 [257]。 ) 溶剂和样品 ( 液相色谱级乙腈购自 Merck (Darmstadt， Germany)。新制超纯 水产自配置0.22 pm 膜式终端过滤 器(Millipak) 的 Milli-Q Integral水纯 化系统。甲酸、 二甲基亚砜和制备型 样品的八种组分均为分析纯或更高， 均购自 Sigma-Aldrich (Taufkirchen，Germany)。 ) 色谱条件 表1.制备型梯度，使用21.2×100 mm， 5 pm色谱柱 参数 描述 流动相 A) 0.1%甲酸水溶液 B) 0.1%甲酸乙腈溶液 流速 25 mL/min 梯度 筛选梯度： 优化后梯度： 0.00 min -10% B 0.00 min - 10% B 0.60 min- 10% B 0.60 min -10% B 6.00 min - 90% B 7.00 min - 70% B 6.01 min-98% B 7.01 min-98%B 7.00 min -98% B 8.00 min - 98% B 7.01 min-10%B 8.01 min -10% B 停止时间 8.50 min 9.50 min 进样量 250pL 检测 UV 254 nm， 无参比 表2.用于馏分重新分析的分析型梯度，使用4.6×50 mm， 5 pm 色谱柱 参数 描述 流动相 A) 0.1%甲酸水溶液 B) 0.1%甲酸乙腈溶液 流速 1.5mL/min 梯度 0.00 min -10% B 0.30 min - 10% B 3.00 min-64% B 3.10 min-98% B 4.10 min- 98% B 4.11 min-10%B 停止时间 5.50 min 进样量 5pL 检测 UV 254nm，无参比 峰宽>0.013 min (20 Hz) 表3.MSD 雾化室和信号设置 参数 描述 补偿流量 1.5 mL/min 补偿溶剂 甲醇/水80：20+0.1%甲酸 雾化室 安捷伦喷射流电喷雾 信号1 正离子扫描125-725 碎裂电压125V 信号2 负离子扫描125-725 碎裂电压125V 雾化器压力 35 psig 干燥气温度 300°℃ 鞘气温度 250°C 鞘气流速 10.0 L/min 毛细管电压 ±1300V 喷嘴电压 ±2000V 样品由对乙酰氨基酚、磺胺甲基嘧啶钠、咖啡因、尼泊金甲酯、磺胺地托辛、对羟基苯甲酸乙酯、尼泊金丙酯和对羟基苯甲酸乙酯混合物制备，溶于二甲基亚砜，终浓度为10 mg/mL。 结果与讨论 基于时间的收集与体积片段 将粗品完美分离并提纯所有需要纯化的化合物，需要设置适当的馏分收集参数及溶剂梯度。这些参数只能通过实验确定。然而，在大多数情况下，可用的样品量非常少而珍贵，不能在未进行馏分收集的简单筛选实验中被浪费。对于这样的情况，1290 InfinityⅡ制备型 Open-Bed 馏分收集器提供了基于时间的不同馏分模式，可收集预设体积或时间间隔，或指定时间内固定数量的馏分。 表1展示了通过筛选梯度分离制备型样品。馏分收集设置为基于时间收集体积片段，定义21 mL 的体积片段，其为16×150 mm 收集管的最大填充体积。该馏分收集模式在0.00-7.00分钟内激活，能将全部化合物非特异性收集成九种不同的馏分(图1)。除了第一次粗馏分收集外，所收集的数据可作为确定更复杂馏分收集的最佳时间、阈值和斜率参数的基础。基于此数据文件，仪器控制软件中的馏分预览功能可模拟在接下来的纯化过程中，峰参数变化如何影响馏分收集(图2)。 除了体积片段收集外，基于时间的馏分收集还可与自定义时长的时间片段收集结合。第三种模式收集用户指定数量的馏分，馏分分布在时间表中定义的特定时间范围内。 收集开始 图1.采用筛选梯度和基于时间收集体积片段馏分模式对制备型样品进行纯化。蓝线和红线分别代表九种所收集馏分的开始和停止时间 图 2. Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版中馏分收集器的方法设置，显示了收集时间表、可用的馏分模式和馏分预览。后者可帮助用户查看阈值、斜率和时间设置的变化如何影响馏分收集 基于峰的收集与体积片段回收 采用筛选梯度的另一种非特异性馏分收集方法是基于峰的体积片段回收馏分模式。在这里，用户可以根据他们的经验和预期样品浓度以及回收片段体积，估算并输入峰阈值和斜率的基本参数。然后，馏分收集将在时间表指定的时间开始体积片段回收。当信号高于输入的阈值或斜率参数时，馏分模式将转换为基于峰的模式，并根据信号收集不同的馏分。这样目标化合物可以收集在单一的馏分中，而体积片段回收收集可以防止阈值/斜率参数未正确设置时的任何样品损失。 图3展示了采用此馏分模式的色谱图和所收集的馏分。类似于基于时间的简单馏分模式，第一个和最后两个馏分为纯回收收集，不包含任何主峰。这八种样品化合物分别收集在不同馏分中。需要注意的是，基于峰的收集优先于体积片段回收，因此峰之间的体积片段小于定义的 21 mL。收集开始和结束的时间也可在时间表中定义，可以仅收集指定的峰。 第二种回收收集模式是将基于峰的馏分收集与用户自定义时长的时间片段收集相结合。除了回收收集，，1290Infinity Ⅱ制备型Open-Bed 馏分收集器还有另一种基于峰收集和时间或体积片段收集的组合，在后面的章节中将对此进行介绍。 收集开始 0.00 min 收集结束 7.00 min 图3.采用筛选梯度和基于峰的体积片段回收馏分模式对制备型样品进行纯化。八个样品组分收集于不同的馏分中，同时将剩余的色谱图切割成≤21mL的体积片段 包含时间片段的基于峰的收集 要找到正确的峰阈值和斜率参数以收集最高纯度的峰，同时避免切割过多峰前部和尾部，是非常困难的。但是这项挑战性的任务能够通过基于峰收集时间片段和基于峰收集体积片段的馏分模式解决。在其中任一模式中，需要定义峰阈值或斜率的参数，以及时间或体积片段时长。旦信号高于阈值/斜率参数，馏分收集器立即开始收集，并根据用户自定义的片段时长/体积将峰切割成多个馏分。此馏分模式让用户能够定义保守的峰阈值/斜率参数，并在收集和重新分析后决定峰前部和尾部最外部分的馏分是该使用还是由于纯度不够进行丢弃。 图4展示了用梯度记录的色谱图的裁剪图，有意使化合物4和5几乎不能完全分离。通过基于峰的馏分收集对这两个峰进行收集，时间片段为0.04分钟。将两个峰均切割成九个片段，分别由 20 mAU 的阈值和 20mAU/s的正斜率设置组合触发。在另一个实验中，在分析系统上对每个馏分的纯度进行测定。 图5展示了化合物4最后三个时间片段和化合物5前两个时间片段重新分析的叠加色谱图。馏分4.7包含纯化合物4，而最后两个片段(4.8和4.9)已包含痕量化合物5。同样，化合物5的第一个体积片段也包含痕量化合物4。为了获得高纯度的化合物4和化合物5，需要将这相邻的三个馏分丢弃。有关 Agilent 1290 Infinity Ⅱl制备型 Open-Bed 馏分收集器峰纯度和回收率的问题将在另一篇技术概述中详细介绍。 图4.采用优化后的梯度和基于峰收集时间片段馏分模式对制备型样品进行纯化(裁剪图)。化合物4和5几乎无法完全分离，并在九个时间片段(每个时间片段为 0.04 min)中进行收集 图5.馏分重新分析的叠加：使用基于峰收集时间片段馏分模式收集馏分4.7到5.2(见图4)。重新分析表明，化合物4的最后两个馏分中含有痕量化合物5，化合物5的第一个馏分中含有痕量化合物4 基于峰的收集 当目标化合物完全分离并且已知适当的峰阈值和斜率参数时，基于峰的馏分收集是首选方法。此馏分模式可在不同时间窗口或整个运行时间内激活，并且仅收集满足用户定义阈值或斜率参数的峰。 使用优化的梯度和基于峰的馏分收集(从4.00至7.50分钟)来纯化制备型样品，因此丢弃前三种化合物。将信号阈值设置为20mAU， 并将正斜率和负斜率分别设置为 20 mAU/s和5mAU/s。将阈值和斜率设置相结合能够更好地分离馏分：如果两个峰没有完全基线分离且峰谷高于阈值，那么若收集仅由阈值触发，两个峰将结合成一个馏分。而通过负斜率和正斜率参数，两个峰之间下降和上升的信号斜率将会触发其分离为不同馏分(图6)。另外，正斜率参数可以防止错误触发；如果基线缓慢上升到阈值以上，那么直到峰导致信号以陡峭的斜率上升时才会开始进行馏分收集。 通过UV和 MSD 信号进行基于峰的收集 为实现最高特异性，在每个基于峰的馏分模式下，可以通过 UV信号和MSD 信号的组合触发馏分收集。每次运行可指定多个目标质量数，既可以在方法中全局设置，也可以按顺序为每个样品单独设置。在 MSD 馏分收集参数中，离子形态可以从常见加合物(±H*、+Na*、+CI等)列表中选择或随意输入。采用这一馏分模式，无论是重叠峰还是复杂样品基质，化合物都可以最高特异性进行纯化。 使用UV 和 MSD 信号的逻辑 AND 组合分离制备型样品，以高特异性地收集化合物5。采用基于峰的馏分收集，其UV触发参数与前一示例相同。另一MSD 信号阈值设置为 50000 cps，样品目标质量数为 310 Da。离子形态只选择质子化/去质子化，并同时监测 MSD 正负信号。 图7为在UV 和 MSD 信号中显示馏分标记所得到的色谱图。与前一示例相反，4.00至7.50分钟收集窗口内的峰并未全部收集，仅收集同时超过UV 和 MSD 阈值设定值的峰。 图6.使用优化的梯度和基于峰的馏分模式对制备型样品进行纯化，在4.00至7.50分钟内激活。需要注意，化合物6中的杂质与主峰收集到不同的馏分中从而得到分离 图7.采用优化的梯度和具有UV 和 MSD 信号逻辑 AND 组合的基于峰的馏分模式对制备型样品进行纯化 本示例中选择的逻辑 AND 连接是最具限制的模式，只有当两个检测器信号均高于阈值时才会触发馏分开始收集，一旦其中一个检测器信号低于设置值时便会立刻结束馏分收集。不同的是，将UV 和 MSD 信号以逻辑 OR连接， 一旦其中一个检测器信号高于阈值就会开始进行馏分收集。但这种模式存在不利因素，因为仅超过 UV阈值时也会触发峰的收集，从而掩盖了 MSD 的特异性。 Agilent 1290 Infinity ll制备型Open-Bed 馏分收集器支持第三种UV 和MSD 信号的逻辑连接，称为 AND/OR。这种模式结合了另外两种模式的优点：馏分收集通过 UV 和 MSD 被高特异性触发，仅当两个检测器信号均高于预设阈值/斜率设置时才开始收集。馏分不断收集，直到两个检测器均发送停止信号时才会停止。与AND连接相反， AND/OR 连接允许在 MS信号中有更大的峰宽，且不会过早地切断馏分收集。如果希望体现MSD特异性，那么通过 UV 和 MSD三种逻辑连接选择可保持最大的灵活性，并在任何给定的情形下提供最佳解决方案。 结论 除了更大的容量和馏分床更加灵活的配置，Agilent 1290 Infinity Ⅱl制备型Open-Bed 馏分收集器还为不同的纯化挑战需求量身定制了新的组合馏分模式。本技术概述提供了这些馏分模式的应用示例和采集结果，包括结合体积片段的基于时间的收集、结合时间片段的基于峰的收集以及两种回收收集模式。通过紫外 (UV)和质量选择检测(MSD)信号的结合展示了基于峰的馏分收集，这两种信号可通过布尔AND 以及新型 AND/OR 逻辑连接。 ( 参考文献 ) ( 1. Agilent 1290 Infinity Ⅱ制备型Open- Bed 馏分收集器一全面收集，滴水 不漏，安捷伦科技公司产品样本， 出版号5991-7225CHCN， 2 016 ) ( 2. Rieck， F . PerformanceCharacteristics of the 1290 Infinity Il Preparative Open-Bed FractionCollector - Purity and Recovery of Collected Compounds (Agilent1290 Infinity Ⅱ制备型 Open-Bed 馏分收集器的性能特性一所收集化合物的纯度和回收率)，安捷伦科技公司技术概述， 出版号5991-7655EN， 2016 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn ( 免费专线： ) 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) ( 联系我们： ) LSCA-China_800@agilent.com ( 在线询价： ) www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( @ 安捷伦科技(中国)有限公司，2016 ) ( 2016年12月1日， 中国出版 ) 5991-7654ZHCN 摘要Agilent 1290 Infinity II 制备型 Open-Bed 馏分收集器为高效灵活地进行馏分收集树立了新标杆。馏分床可单独配备 6 个容器，容纳 8 种不同尺寸的馏分管。三个抽屉让您即使在运行期间也能轻松获取已收集的馏分。基于峰和时间的馏分模式已扩展至八种组合模式，能对体积或时间片段进行收集，且包括两种回收收集模式。紫外 (UV) 和质量选择检测 (MSD) 信号的触发组合现包含一个 AND/OR 逻辑算符，为挑战性纯化提供了额外的灵活性。本技术概述将提供馏分模式（包括收集结果）更深层次的介绍以及典型应用示例。前言馏分收集是将分析型高效液相色谱(HPLC) 系统转变为纯化系统的关键特征。听起来可能简单，但一般来讲，馏分收集（尤其是制备型纯化）确实存在有挑战性的地方。制备型 HPLC 的流速范围为 5–100 mL/min 或以上，生成的馏分体积从不足 1 mL 到高达数十或数百 mL。若要最大程度利用馏分收集器的容量，便需要不同尺寸的收集容器。所收集的馏分需快速处理（ 重新分析、混合和溶剂蒸发），因此还需要一个易于操作的馏分床。Agilent 1290 Infinity II 制备型 Open-Bed 馏分收集器包含新功能和改进的功能，可以解决所有这些问题。带有不同直径（12、16、25、30 mm）和长度（100 或 150 mm）馏分管的馏分容器经过优化，可容纳 8–78 mL 的馏分。馏分床可单独配备 6 个容器，最多可容纳 432 个单馏分，或最大5940 mL 的馏分体积。三个抽屉将馏分床分隔开，即使在运行期间也能交换整个抽屉。只有当前使用的抽屉处于锁定状态，以防溢液和样品损失。根据所使用的流速，可为最佳设置配备不同内径的管线工具包。与 Agilent 1260 Infinity 馏分收集器一样，1290 Infinity II 制备型 Open-Bed 馏分收集器具有内置延迟传感器，无需更改任何硬件便能精确校准检测器和馏分阀之间的延迟。(MSD) 信号组合触发的馏分收集也可通过第三种模式得到扩展，结合了逻辑 AND/OR 连接的优点。本技术概述介绍了 Agilent 1290 Infinity II 制备型 Open-Bed 馏分收集器中可用的不同馏分收集模式，以及功能增强的典型应用。结论除了更大的容量和馏分床更加灵活的配置，Agilent 1290 Infinity II 制备型 Open-Bed 馏分收集器还为不同的纯化挑战需求量身定制了新的组合馏分模式。本技术概述提供了这些馏分模式的应用示例和采集结果，包括结合体积片段的基于时间的收集、结合时间片段的基于峰的收集以及两种回收收集模式。通过紫外 (UV) 和质量选择检测 (MSD) 信号的结合展示了基于峰的馏分收集，这两种信号可通过布尔 AND 以及新型 AND/OR 逻辑连接。