发酵培养基中氨基酸检测方案(液相色谱仪)

应用简报 AgilentTrusted Answers 利用未衍生化氨基酸的 LC/MS分析进行生物反应器细胞培养监测 Jordy Hsiao、Te-Wei Chu、Andrew Kennedy、Adam Bivens 和Anne Blackwell 本应用简报介绍了发酵培养基中氨基酸 LC/MS分析的解决方案。氨基酸的极性使其难以进行反相液相色谱分析，因此通常使用衍生化来改善其保留能力。然而，亲水相互作用色谱 (HILIC) 无需衍生化也能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有与传统反相液相色谱类似的工作流程。 HILIC 与质谱的组合提供了一种极其简单而功能强大的未衍生化氨基酸分析解决方案。 监测生物反应器和发酵培养基中发现的各种极性化合物，是亲水相互作用色谱 (HILIC) 的一种挑战性实际应用。使用高 pH条件与负离子模式 LC/MS 检测，可以在一次分析中实现对氨基酸、原料与废弃物的监测。Agilent AdvanceBio MS SpentMedia 的键合相在高 pH流动相下具有出色的稳定性，非常适合该体系的分离。 尽管基质的分析充满挑战性，进样间的重现性仍十分优异。中空纤维反应器和转瓶反应器的检测结果揭示了培养细胞的葡萄糖和氨基酸消耗以及乳酸分泌。 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC级或更高等级。超 LC/MS级乙腈购自 J.T.Baker (Center Valley， PA， USA)。水的净化处理由 EMD MilliporeMilli-Q Integral 系统 (Darmstadt， Germany) 完成。试剂级甲酸(FA，部件号 G2453-85060)来自安捷伦科技公司。甲酸铵、乙酸铵、氢氧化铵和氨基酸标样购自 Sigma-Aldrich (St.Louis， MO， USA)。 DMEM 培养基购自赛默飞(Waltham， MA，USA)。氨基酸在使用前于-70℃下储存。 仪器与材料 ( Agilent InfinityLab 接头 ) ( 色谱柱前端： Agilent Quick Conne c t 快速连接接头 (部件号5067-5965) ) ( 色谱柱末端： Agilent Quick Turn 接头(部件号5067- 5966) ) ( 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，已认证， 2 mL，100/包 ( 部件号5182-0716) ) ( 安捷伦固定螺口盖， PTFE/红色硅橡胶隔垫(部件号 5190-7024) ) ( 安捷伦样品瓶内插管，250pL，去活玻璃，带聚合物支脚 (部件号5181-8872) ) ( Eppendorf移液器和连续分液器 ) ( 超速离心仪(VWR， Radnor， PA， USA) ) ( 涡旋仪和多管涡旋仪(VWR，Radnor， PA， USA) ) ( HDPE 溶剂瓶 (VWR， Radnor， PA， USA) ) ( 转瓶生物反应器 (Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USA) ) ( 中空纤维生物反应器(FiberCell Sys t ems， New Market， MD，USA) ) ( · Agilent 1290 InfinityⅡ二元泵 (G7120A) ) ( Agilent 1290 Infinity ⅡI样品瓶进样器 (G7129B) ) ( Agilent 1290 Infinity lI 高容量柱温箱(G7116B) ) ( Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超低扩散工具包 (5067-5189) ) Agilent 6545四极杆飞行时间 (Q-TOF)质谱仪 安捷伦喷射流电喷雾离子源 软件 Agilent MassHunter 工作站软件 B.08.00 样品前处理 将细胞培养样品用50%乙腈稀释4倍，并以10000×g的速度离心10分钟。收集上清液并进样，无需进一步样品前处理。 流动相 用水配制100mM 乙酸铵储备液，并用氢氧化铵将 pH 调节至9.将水与储备液按9：1稀释制得流动相A。将乙腈与储备液按9：1稀释制得流动相B。两种流动相的乙酸铵最终浓度均为10mM。流动相与玻璃器皿过度接触会引入离子物质，干扰并抑制质谱检测。储存在玻璃瓶中的流动相应定期更换，或转移至 HDPE瓶中。 仪器条件 表1.细胞培养基的组成 (DMEM 生长培养基) HPLC 条件 色谱柱 Agilent AdvanceBio MS Spent Media， 2.1×150mm(部件号673775-901) 流动相A 10%(100mM乙酸铵水溶液， pH=9) /90% 水 流动相B 10% (100mM乙酸铵水溶液，pH=9)/90%乙腈 梯度 时寸(min) %B 0 90 2 90 12 40 20 1316 20 17 9025 90 流速 0.25 mL/min 柱温 30°C 进样量 1pL 总运行时间 25分钟 质谱条件 电离模式 ESI负离子模式 干燥气温度 200℃ 干燥气流速 10 L/min 雾化器 40 psi 鞘气温度 300℃ 鞘气流速 12L/min 毛细管电压 3000V 喷嘴电压 0V 碎裂电压 125V 锥孔电压 65V Oct RF Vpp 750V 采集参数 数据在2 GHz 扩展的动态范围下采集，质量数范围为50-1000 m/z 生物反应器条件 参数 值 生物反应器形式 转瓶生物反应器 中空纤维生物反应器 细胞系 中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞 培养基 DMEM 生长培养基 温度 30℃ 图2.细胞培养基分析，显示出氨基酸的消耗。在中空纤维生物反应器中的生长培养基中补充6mM谷氨酰胺，因此导致中空纤维生物反应器中的谷氨酰胺水平高于对照生长培养基和耗尽营养物的转瓶生物反应器 图3.细胞培养基分析，显示出葡萄糖养料的消耗和乳酸的分泌 表2.细胞培养基保留时间和每种分析物的主要离子形态 监测的分析物 保留时间(min) 母离子(m/z) 苯丙氨酸 3.55 164.072 乳酸 3.95 89.024 亮氨酸 3.98 130.087 色氨酸 3.98 203.083 异亮氨酸 4.35 130.087 甲硫氨酸 4.53 148.043 D-葡萄糖(a-异构体) 4.87 179.056 酪氨酸 4.91 180.066 D-葡萄糖(β-异构体) 5.13 179.056 缬氨酸 5.19 116.071 甘氨酸 6.28 74.0247 苏氨酸 6.29 118.051 谷氨酰胺 6.67 145.06 丝氨酸 6.73 104.03 组氨酸 6.75 154.062 精氨酸 12.53 173.104 赖氨酸 13.01 145.098 Spent 培养基中的氨基酸在 HILIC-MS 的负离子模式下成功得到了分析。通常难以分析的亮氨酸/异亮氨酸同量异位素实现了基线分离，分离度为1.6。氨基酸作为两性离子，在正离子和负离子模式下都容易电离，但在高 pH负离子模式下能够实现对细胞培养基、原料和细胞废弃物的同时监测。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2018 ) ( 5991-8816ZHCN ) 摘要    本应用简报介绍了发酵培养基中氨基酸 LC/MS 分析的解决方案。氨基酸的极性使其难以进行反相液相色谱分析，因此通常使用衍生化来改善其保留能力。然而，亲水相互作用色谱 (HILIC) 无需衍生化也能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有与传统反相液相色谱类似的工作流程。HILIC 与质谱的组合提供了一种极其简单而功能强大的未衍生化氨基酸分析解决方案。前言监测生物反应器和发酵培养基中发现的各种极性化合物，是亲水相互作用色谱 (HILIC) 的一种挑战性实际应用。使用高 pH条件与负离子模式 LC/MS 检测，可以在一次分析中实现对氨基酸、原料与废弃物的监测。Agilent AdvanceBio MS SpentMedia 的键合相在高 pH 流动相下具有出色的稳定性，非常适合该体系的分离。尽管基质的分析充满挑战性，进样间的重现性仍十分优异。中空纤维反应器和转瓶反应器的检测结果揭示了培养细胞的葡萄糖和氨基酸消耗以及乳酸分泌。结论    Spent 培养基中的氨基酸在 HILIC-MS 的负离子模式下成功得到了分析。通常难以分析的亮氨酸/异亮氨酸同量异位素实现了基线分离，分离度为 1.6。氨基酸作为两性离子，在正离子和负离子模式下都容易电离，但在高 pH 负离子模式下能够实现对细胞培养基、原料和细胞废弃物的同时监测。