人尿中乌头碱及其代谢产物检测方案(液质联用仪)

基于高分辨质谱进行代谢物鉴定的高效流程：四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱QExactive鉴定人尿样中乌头碱及其代谢产物 江峥，叶芳挺(赛默飞世尔科技) 引言 体内代谢物研究主要针对各类生物基质样本，如全血、血浆、血清、尿样、胆汁或组织等，对其中痕量的代谢物进行分离、结构鉴定或定量分析。液相色谱质谱联用技术 (LC-MS)以其分离效率高、检测速度快、定性和定量能力强等优势，被广泛应用于体内代谢物研究，而其中高分辨质谱的使用更是趋于普及。以高分辨静电场轨道阱orbitrap为核心的串联质谱平台Q Exactive，具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可快速正负切换扫描等优点，可有效提高代谢物研究的分析通量和分析效果，尤其对于复杂基体中的痕量代谢组分的识别效率好、同时定性和定量能力强。配合相应的代谢物研究软件， QExactive为生物基质样品中目标或非目标代谢物的定性鉴别和定量分析提供了完整高效的高分辨质谱分析流程。 乌头属(Aconitum)类植物中的生物碱类成分具有镇痛、抗炎、抗癫痫、抗肿瘤、提高免疫力等生理活性，用以治疗跌打损伤等病症。但其中所含的乌头碱(Aconitine) 等双酯二萜生物碱安全系数小，治疗剂量与中毒剂量接近，加之对毒物耐受性的个体差异、误服或投毒等原因，常引起乌头碱中毒。乌头碱中毒无特异性临床表现，至今没有准确的法医鉴定及临床诊断方法。此外，乌头碱在体内浓度低、代谢速度快，因此研究乌头碱在人体内的代谢过程，通过代谢产物表针其中毒情况和中毒程度，对于刑侦断案以及临床施救都有着实际应用价值。乌头碱体内代谢物研究主要面临以下几个难点：：一是乌头碱代谢迅速，尿样中的原药及代谢物浓度低；；二是生物样品复杂，内源性干扰严重；三是代谢途径多样，代谢物众多。因而，对于高分辨质谱系统要求其全质量轴的扫描灵敏度高、特异性强、质量精度好、动态范围宽且可采用多种扫描方式用以最完整和可靠的代谢物鉴定。 实验目的 建立以Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱为核心的代谢物鉴定高效流程，用于准确、快速地筛选和定性目标及非目标代谢产物，提高代谢物鉴定的覆盖率，尤其是含量较低的代谢产物的检出效率。以人体内乌头碱代谢物鉴定为例，对24、48、72小时所采集尿样中的代谢产物进行高分辨质谱分析。 实验条件 液相色谱条件 ·色谱系统： Thermo Scientific Accela 600快速液相色谱系统 色谱柱：Hypersil Gold C18 (50×2.1mm， 1.9pm) •进样量：10山L 流动相A： 10mM醋酸铵水溶液 流动相B： 乙腈 流速： 300 p L/min 梯度： 时间(min) A% B% 0.00 95 5 1.00 95 5 14.00 50 50 14.01 5 95 17.00 5 95 17.01 95 5 20.00 95 5 质谱条件 ·质谱系统：QExactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱 ·参数设置： 离子源参数 扫描参数 离子化方式 HESI(+) MS分辨率 70，000 FWHM 喷雾电压 3000V MS2分辨率 17，500 FWHM 鞘气 35 arb 扫描范围 m/z 200-1200 辅助气 10 arb 裂解方式 HCD 离子传输管 温度 350°C 碰撞能量 35% 数据分析 Q Exactive采集的数据文件由专业的代谢物鉴定软件MetWorks进行处理，自自动筛选并定性可能的代谢产物。MetWorks支持高分辨质谱数据，软件中集成了I相、Ⅱ相和川相代谢通路，仅需提供母体药物的分子式或者结构就能够依据精确质量数自动检索数据文件中已知代谢方式的目标产物。除次之外，MetWorks也能够通过MMDF(多重质量亏损过滤)排除总离子流色谱图中的干扰信号，放大低浓度代谢物的响应。对于非目标代谢产物，软件可以通过二级谱图相关性、空白及样品中组分对比分析、同位素匹配、色谱峰检索等多个角度进行代谢物的筛查，以确保最为完整的代谢物鉴定覆盖率。 结果 代谢物鉴定通常以体内或体外生物基质样品为研究对象，代谢产物结构迥异且浓度高低不一，因此对于质谱系统要求具备足够高的分辨率以区别与目标分析物质量数接近的干扰组分，足够准确和稳定的精确质量数测定能力以在整个分析周期内获得有效的样品数据，同时也需要足够高的灵敏度和足够宽的动态范围以满足各种浓度水平代谢物的检测。基于Orbitrap静电场轨道阱高分辨质谱技术的Q Exactive LC-MS/MS系统不仅具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高的特点，还能够提供正负切换扫描、数据关联MS/MS扫描、中性丢失扫描等多种高分辨数据采集模式，以便获得最为全面的代谢物筛选和鉴定所需的数据。所采集的高分辨数据文件可直接导入MetWorks代谢物鉴定软件，仅需在软件中输入母药的分子式或结构式，即能自动根据内置的代谢通路、MS/MS谱图相关性、同位素特征等信息对目标及非目标代谢产物进行多角度的定性分析，最终生成报告。Q Exactive高分辨质谱与MetWorks代谢物鉴定软件，构成了一套完整、高效、快速的代谢物鉴定流程，无论是目标还是非目标、高浓度还是低浓度的代谢物，都能够获得最佳的鉴定效果(图1为代谢物鉴定流程)。 根据上述代谢物鉴定流程，对24hr、48hr、72hr采集的尿样中乌头碱的代谢物进行筛查，分别鉴定出49、 40、14种代谢产物。图2为24hr采集尿样中所鉴定出的部分代谢产物，以精确质量数对目标组分信号进行提取，提取窗口为5ppm。表1中列出了主要代谢产物的代谢修饰方式、保留时间及实测精确质量数等信息，大部分化合物的质量精度均在1ppm以内。 RT：0.00-20.00 SM：15G 图2：24hr尿样中部分代谢产物的提取离子流色谱图(质量提取窗口5ppm) 图1：基于QExactive高分辨质谱及MetWorks软件的代谢物鉴定流程 表1：所鉴定出的主要代谢产物及精确质量数测定结果 对于通过一级全扫描鉴定出的代谢产物，QExactive可通过母离子列表形式，有针对性的采集目标代谢物的二级高分辨质谱数据，用于进一步的结构确证。以脱乙酰基的代谢产物M33为例，图3中显示了M33的二级高分辨质谱对比图。M33碎裂后可产生与乌头碱类似的碎片离子，提示其主要结构与乌头碱类似，为其脱侧链乙酰基后的产物。QExactive的HCD高能碰撞碎裂模式可获得M33丰富的碎片离子用于结构确证(图3)，且基本所有MS/MS二级离子的精确质量数均在1ppm以内，可通过软件确定碎片离子的元素组成，对其碎裂途径进行合理归属，用于该代谢物的结构确证。 结论 通过应用Q Exactive四极杆-静电场轨道阱串联高分辨质谱系统，大大提高了体内代谢物的鉴定和结构确证的效率，简化了仪器操作和数据解析的流程。通过精准的一级高分辨全扫描、数据关联MS/MS扫描以及正负切换扫描，全面采集可能代谢产物的高分 辨质谱数据，分别采用MS和MS/MS精确质量数对代谢物进行定性筛查和结构确证。Q Exactive的超高分辨率和精确的质量数测定功能，大幅减少了假阳性结果，提升整体的数据结果质量。MetWorks代谢物鉴定软件中的MMDF功能有效滤除基质中的信号号扰，从多维角度对痕量代谢组分进行自动筛查。对24hr、48hr、72hr采集的人体尿样中的乌头碱及其代谢物进行鉴定，共鉴定出近50种代谢产物，即使在服药3天后依然能检出14种代谢物。所采用MS和MS/MS数据关联扫描，使得一次进样同时获得高分辨一级和二级质谱普据，用于代谢产物研究。Q Exactive的特异性和灵敏度也使其成为兼具优异的同时定性和定量功能，成为最佳的体内或体外代谢物研究的全能高分辨质谱平台。 ( 参考文献 ) ( [1]王朝虹等.液相色谱质谱联用测定乌头碱在大鼠体 内代谢物.中国法医学杂志.2006，21(2)： 88-90 ) ( [2]张宏桂等.兔血液中乌头碱代谢物的研究.吉林大 学学报.2006，44(2)：284-286 ) Part of Thermo Fisher Scientific 体内代谢物研究主要针对各类生物基质样本，如全血、血浆、血清、尿样、胆汁或组织等，对其中痕量的代谢物进行分离、结构鉴定或定量分析。液相色谱质谱联用技术（LC-MS）以其分离效率高、检测速度快、定性和定量能力强等优势，被广泛应用于体内代谢物研究，而其中高分辨质谱的使用更是趋于普及。以高分辨静电场轨道阱orbitrap为核心的串联质谱平台Q Exactive，具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可快速正负切换扫描等优点，可有效提高代谢物研究的分析通量和分析效果，尤其对于复杂基体中的痕量代谢组分的识别效率好、同时定性和定量能力强。配合相应的代谢物研究软件，Q Exactive为生物基质样品中目标或非目标代谢物的定性鉴别和定量分析提供了完整高效的高分辨质谱分析流程。     乌头属（Aconitum）类植物中的生物碱类成分具有镇痛、抗炎、抗癫痫、抗肿瘤、提高免疫力等生理活性，用以治疗跌打损伤等病症。但其中所含的乌头碱（Aconitine）等双酯二萜生物碱安全系数小，治疗剂量与中毒剂量接近，加之对毒物耐受性的个体差异、误服或投毒等原因，常引起乌头碱中毒。乌头碱中毒无特异性临床表现，至今没有准确的法医鉴定及临床诊断方法。此外，乌头碱在体内浓度低、代谢速度快，因此研究乌头碱在人体内的代谢过程，通过代谢产物表针其中毒情况和中毒程度，对于刑侦断案以及临床施救都有着实际应用价值。乌头碱体内代谢物研究主要面临以下几个难点：一是乌头碱代谢迅速，尿样中的原药及代谢物浓度低；二是生物样品复杂，内源性干扰严重；三是代谢途径多样，代谢物众多。因而，对于高分辨质谱系统要求其全质量轴的扫描灵敏度高、特异性强、质量精度好、动态范围宽且可采用多种扫描方式用以最完整和可靠的代谢物鉴定。通过应用Q Exactive四极杆-静电场轨道阱串联高分辨质谱系统，大大提高了体内代谢物的鉴定和结构确证的效率，简化了仪器操作和数据解析的流程。通过精准的一级高分辨全扫描、数据关联MS/MS扫描以及正负切换扫描，全面采集可能代谢产物的高分辨质谱数据，分别采用MS和MS/MS精确质量数对代谢物进行定性筛查和结构确证。Q Exactive的超高分辨率和精确的质量数测定功能，大幅减少了假阳性结果，提升整体的数据结果质量。MetWorks代谢物鉴定软件中的MMDF功能有效滤除基质中的信号干扰，从多维角度对痕量代谢组分进行自动筛查。对24hr、48hr、72hr采集的人体尿样中的乌头碱及其代谢物进行鉴定，共鉴定出近50种代谢产物，即使在服药3天后依然能检出14种代谢物。所采用MS和MS/MS数据关联扫描，使得一次进样同时获得高分辨一级和二级质谱数据，用于代谢产物研究。Q Exactive的特异性和灵敏度也使其成为兼具优异的同时定性和定量功能，成为最佳的体内或体外代谢物研究的全能高分辨质谱平台。