尿液中核苷含量检测方案(离子色谱仪)

结果和讨论 潘广文 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 离子色谱；脉冲积分安培；核苷；尿液 Keywords：ion chromatography，IPAD， nucleosides，urine 引言 恶性肿瘤(癌)是常见的恶性疾病之一，年死亡人数达450万之众，仅次于心脑血管疾病，占各种疾病死亡率的第二位。根据现代的医学水平，恶性肿瘤早期发现治愈率将大大提高。如果能够实现早期诊断，60-90%以上的病人可以被治愈。目前癌症诊断技术主要包括图像技术(CT和核磁共振)、细胞学和组织学诊断以及化学诊断(包括癌反应、血清学和免疫指标)三种，其中后两种技术均以肿瘤标记物作为观察指标。肿瘤标记物是肿瘤组织和细胞由于癌基因及其产物的异常表达所产生的生物物质，它存在于癌症病人的组织、体液和排泄物中，能够用生化或免疫化学的方法定量的检出。目前的肿瘤标记物包括：肿瘤抗原、酶、激素、特异性蛋白、癌基因以及癌基因表达产物等。肿瘤标记物在临床上发挥着非常重要的作用。细胞中的核糖核酸(RNA)，特别是转运核糖核酸(tRNA)中除含有四种正常核苷：腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U)外，还有大量修饰核苷。所有修饰核苷是在大量高度特异性的修饰酶的作用下，尤其是甲基转移酶和连接酶的作用下产生的。RNA中的修饰核苷的作用机理尚不清楚。正常的未被修饰的核苷可以在酶的作用下，被磷酸酯化后再利用形成新的RNA，或降解为尿酸和β-丙胺酸。而修饰核苷十分稳定，既不易代谢也不能被磷酸酯化再利用，因此在尿中被定量排放。在尿中，修饰核苷的含量分布在一个较窄的范围。当人体的某一部分发生癌变时，核糖核酸周转加快，导致尿液或血液中修饰核苷的含量急剧增加。研究发现，通过测定尿或血液中的修饰核苷的增加程度，，可对癌症的发病进行早期诊断。修饰核苷在临床上被认为是一种潜在的肿瘤标记物。 仪器： ICS-5000色谱仪(Thermofisher公司)，配四元梯度泵，ED安培检测器， AS-AP自动进样器 ( 色谱柱： CarboPac PA 20保护柱6.0um，50×3 mm， ( P/N： 060144) CarboPac PA 20分离柱6.0um， 150×3mm， (P/N： 060142 ) ) 柱温：30℃； 淋洗液： NaOH/ NaOAc梯度淋洗 流速： 0.4mL/min； 定量环：10pL； 检测方式：脉冲积分安培检测(四电位波形) 本实验采用离子色谱法脉冲安培法分离测定7种核苷，分离度好，灵敏度高，操作简便，建立了一种有效检测尿液中核苷的方法。 取尿液样品，加入适量25%的NaOH， 于离心机中离心20分钟(3000rpm)，上清液稀释适当倍数后，经过0.22pm尼龙滤膜过滤，取续滤液直接上机分析。 色谱柱的选择及淋洗液梯度条件优化 核苷结构中含有碱基基团和糖单元，极性较大。在强碱性条件下，可解离为阴离子，以阴离子模式在阴离子交换柱中有保留；不同碱基的离解性不同在色谱柱中的保留不同，能够实现分离。核苷结构中均含有羟基，能够在安培检测器上有信号。为了保证色谱峰的分离度和保留时间的合理性，我们选择CarboPac PA 20的糖柱和NaOH/NaOAc梯度淋洗的方式。在上述色谱条件下几种物质的色谱图如下图(图1)。 图1.标准溶液的色谱图 Figure 1 Chromatogram of standard solution (2.0mg/L)1-胞嘧啶核苷(cytidine)、2-腺苷(adenosine)、3-胸苷(thymidine)、4-5-甲基尿苷(5-methyluridine)、5-尿苷(uridine)、6-肌苷(inosine)、7-鸟苷(guanosine) 取临床尿液样品，离心稀释后经过0.22um滤膜过滤，按选定的色谱条件进行测定，外标法定量，其谱图见图2。 图2.样品溶液的色谱图 1-胞嘧啶核苷(cytidine)、3-胸苷(thymidine)、5-尿苷(uridine) 结论 离子色谱分离脉冲安培检测器测定尿液中核苷的方法操作简便，重复性好，线性范围内相关性好，准确度高。核苷类化合物用液相色谱法来分析非常成熟，但未见离子色谱分离的报道，且离子色谱的方法前处理简单，核苷附近的杂质峰的干扰比较少，具有较高的实用价值。 重现性、线性和灵敏度 将标准品定量混合并将标准品溶液稀释得到一浓度系列，对上述系列浓度各测定3次后，取其峰面积的平均值，以峰面积为纵坐标，标准液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，各种物质的线性范围、回归方程、相关系数、检出限(以信噪比S/N为3计)和相对标准偏差均如表1所示。 表1.方法的线性关系 Table 1 Aggression equation of the ions determined Analytes Linear range Regression equation Correlation LOQ RSD (mgL"1) (mgL") (ugL') coefficient (%) (r) (n=7) cytidine 0.1000-10.0000 Y=0.5230x+0.0503 99.9809 90 1.6484 adenosine 0.3000-10.0000 Y=0.4458x+0.0210 99.9616 200 1.3672 thymidine 0.1000-10.0000 Y=0.6171x+0.1098 99.9000 80 1.7073 5-methyluridine 0.1000-10.0000 Y=0.7264x+0.0794 99.9684 100 1.1160 uridine 0.1000-10.0000 Y=0.7816x+0.0640 99.9640 90 1.2729 inosine 0.3000-10.0000 Y=0.5959x-0.0149 99.9783 200 1.8077 guanosine 0.3000-10.0000 Y=0.7762x+0.0771 99.9738 200 1.9299 ( [1] J. Y. Wang， S. G. Zhu， C. F . Xiu， B iochemstry，Higher E ducation Press. Beijing， 2 007. ) ( [2] A . S eidel， S. Brunner， P. Seidel， G.I. Fritzm， O.Herbarth， B r. J. Cancer 94 (2006) 1726. ) ( [3] F. Dieterle， S . Muller-Hagedorn， H .M. L i ebich， G.Gauglitz， Artif Intell Med 28 (2003) 265. ) ( [4] G. Xu， H.M. Liebich， Am. Clin. Lab.3(2001)22. ) ( [5] K.R. Kim， S. La， A. Kim， J.H.Kim， H.M. Liebich，J.Chromatogr. B 754 (2001)97. ) ( [6] Y. Zheng， G. Xu， J. Yang， X. Zhao， T . Pang， H .Kong， J. Chromatogr. B 8 19 (2005) 8 5. ) ( [7] S.H. Cho， B .H. Jung， S.H. Lee， W.-Y. L e e， G . Kong， B .C. Chung， B iomed. Chromatogr. 20(2006)1229. ) ( [8] H . M. Liebicha， R . Lehmanna， G. Xub， H.G.Wahla， H .-U. H aring， J. of Chromatogr. B 745 (2000) 189. ) ( [9] F.Q. Yang， D.Q. Li ， K. Feng， D.J. Hu， S. P . Li， J.Chromatogr. A 1217 (2010) 5501. ) 免费服务热线：1800 810 5118 ThermoFisherSGIENTIFIC 支持手机用户)