尿液中滥用药物检测方案(气相色谱仪)

实验条件数据处理 识别非预期化合物 药物滥用； GC-MS；尿液；筛查；高分辨； QExactiveGC；Orbitrap 质谱仪；准确质量 简介 药物滥用的特点是对某个药物的使用不按照说明书指导使用，这通常源自具有严重问题的自我管理或者情绪低落。几乎所有服用后让人感觉兴奋的药物都可能被滥用。药物滥用(DoA)的药物包括镇静剂(鸦片类、巴比妥酸、苯二氮卓类、酒精类)、兴奋剂(安非他明、可卡因)、迷幻剂(LSD、莫斯卡林、苯环己哌啶)和大麻类(大麻)。DoA 测试的目的有很多，犯罪或者其他法医调查、高风险的职业功能、临床毒物学、戒毒过程等都需要进行 DoA 测试。对于这类测试，尿液是广泛使用的样品，因为尿液样品具有非侵入式、.可靠经济、使用广泛且具有严格规范 特点，局限性是只能反映当前或者近期物质使用情况，放置2-3天后可能导致结果呈阴性。但是也有一些化合物及其代谢物可以存在较长时间，例如， THC-COOH 和苯二氮卓类。 了尽可能延长有效检测时间，高灵敏度的分析技术非常关键。 Do 的实验室测试是一项极具挑战性的任务。主要因为样品包括各种化学背景，而需要筛查的化合物和代谢物数量众多。另外，这类化合物水平可能很高也可能很低，这取决于样品暴露情况。GC-MS 技术非常适合 DoA 筛查和确证，因为它提供出色的色谱分辨 峰数量以及范围很广的谱库，有利利识别。2， 是，更高的灵敏度和特异性会提高阳性结果的可靠性，并提高系统耐用性，尤其是在高通量实验室环境下的测试。另一个挑战是评 用 GC-MS 生成的信息丰富的电子轰击质谱图 其是当基质和背景离子在分析峰上发生重叠时。 在这篇应用文献中，通过筛查尿液中的 DoA 评估 ThermoScientific Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统性能是否符合药物滥用监控要求。这篇文章的目的是演示采用ThermoScientific. Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统检测和识别 DoA 的非目标物定性工作流程。本文章采用全扫描模式，非目标采集和高分辨率状态分析真实尿液样品，获得精确质量数结果，支持谱库检索。对于扫描速度及扫描间动态范围和高灵敏度的评估，分别为低含量和高含量组分检测展开。另外，也对用于自动解卷积和识别的独特的软件算法进行评估，观其是否适合日常筛查。 样品前处理 University rich 的 Zurich Institute of Forensic Medicine 提供来自真实案例调查的六个尿液样品(A-F)。样品前处理过程如下：在0.5 mL 尿液中加入100 uL 0.5M 的乙酸盐缓冲液，使其PH 值调整为 5.2。加入50 pL 葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶结合物后，在60℃下执行剪切3h。加入200 uL氨缓冲液，采用1mL乙酸乙酯/异丙醇/二氯甲烷混合物(3：1：1，v/v/v) 进行液液萃取。取800pL 有机层蒸干，然后在60℃下加入 100 pL乙酸酐-吡啶混合物(3：2， v/v) 进行乙酰化一小时。对乙酰化的混合物进行蒸发，再将其重新溶解在 100uL 乙酸乙酯中，然后直接用于 GC-MS分析。 仪器和方法设置 所有实验均使用 Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统。使用 Thermo Scientific TriPlus RSH 自动进样器执行进样。使用 Thermo Scientific TRACE 1310 GC 和 ThermoScientific TraceGOLD TG-1MS 30 m× 0.25 mm I.D. × 0.25um (P/N 26099-1420) 毛细管柱进行色谱分离。仪器参数的其他细节显示在表1和2中。 表1.GC 和进样口条件。 进样体积(uL)： 1 衬管： 分流衬管 入口(℃)： 250 载气(mL/min)： He，1.2 分流比： 20：1 柱温箱程序 温度1(℃)： 50 保持时间(min)： 1 温度2(℃)： 325 速率(℃/min)： 10 保持时间(min)： 8.5 表2.质谱仪条件。 Q Exactive 质谱仪参数 传输线(℃)： 250离子化类型： EI离子源(℃)： 250电子能量(eV)： 70 采集模式：全扫描 质量数范围(Da)： 50到600 分辨率 ( m/z200下的FWHM)： 60，000 锁定质量数，柱流失(m/z)： 207.03235 使用 Thermo Scientific TraceFinder 软件采集数据。此软件集成了仪器控制、方法开发及定性和定量工作流程。TraceFinder软件还包括质谱图解卷积和 功能。药物、毒物、农残、污染物及其代谢物的 Maurer/PTleger/Weber 2011 谱库用于质谱图匹配。 用精确质量数和高分辨过滤分值(HRF) 进一步过滤谱库检系结果，完成智能化合物识别。 结果和讨论 本研究的目的是采用非目标全扫描模式分析乙酰化尿液样品，从而使用谱库检索样品中可能存在的化合物。图1总结了完整的工作流程。在高灵敏度和质谱图宽动态范围下，采集全扫描数据，从而可以筛查海量化合物。这实现了数据回顾性分析以及在初次调查时没有筛查到的其他化 检索。这样一个宽范围筛查完全取决于质谱图库中化合物数量的多少和质谱图的质量。在这样的情况下，所使用的谱库包括8670个药物、药物代谢物、污染物以及其他生物分子的质谱图，用于快速可靠检索化合物的数据文件，生成候选化合物列表。随后，高分辨数据用于根据精确质量数智能过滤结果列表。 对每个数据文件进行解卷积，从总离子流色谱图(TIC) 中提取每个峰。从尿液样品获得的全扫描数据由于具有高化学背景得得十分复杂，可参见某一样品(分流比20：1)(图2的芯层离子色谱图。TraceFinder 软件的自动解卷积功能从背景中提取了所有特征，去除了干扰，降低了复杂性。每个峰干净谱图中的解卷积结果只包括同一保留时间下强度最大的离子。然后在 Maurer/Pfleger/Weber 质谱库中检索干净质谱图，完成迭代化合物识别。每个峰的迭代识别结果列表打分是基于典型检索指数。)分数和高分辨过滤分值(HRF)的组合。HRF 值是取取佳佳库匹配结果的化学分子式对应的质谱图百分比。 图 1. Q Exactive GC 系统的筛查工作流程 RT： 0.00-35.00 SM： 7B 图2.尿液样羊的 GC-MS总离子流色色图(分流比20：1) 质谱图中观测的精确质量数、库匹配以及解析离子百分比的组合，为样品中化合物识别提供了一个快速可靠的方法。图3中显示了化合物检测和识别的例子，其中检出了肉豆蔻。这里的峰识别表显示了 16.15 min 下该峰的三种可能匹配。如果只使用 SI，则可能有好几个可能的匹配化合物。但是，当我 们包括了 HRF，根据组合分数再对列表排序，这时最高分数结果(肉豆蔻)为74.3%。其他五个结果都小于 <51%，可以不予考虑。再进一步观察离子的质量数精度，基峰的 m/z180.07799，精度为0.6 ppm， 可进一步确认匹配的化合物。小于1 ppm 的质量数精度可以确保快速准确的化合物识别。 179.07027 2158177 1144533C(12)10 H1...179.07027 0 Library spectrum Figure3. Identification of myristicin using TraceFinder. Spectral deconvolution of the TIC and library search index and the HRF score together withadditional criteria are used for intelligent compound identification. The list of matched compounds (upper) is sorted based on a combined searchindex and high resolution filtering (HRF) score. 应用高分辨进行可靠药物筛查 在 Maurer/Pfleger/Weber 谱库中筛查六个样品，结果总结在表3中从这些样品中提取的信噪比大于100的解卷积峰数目在81 1574 之间。每个样品中少少匹配一个化合物的峰总数为169到263。这个匹配数目相当大，但是在预料之中，因为这个库条目超过了8000。这些匹配化合物不仅包括 DoA， 还包括类似尿液的复杂样品中可能存在的污染物和生物分子。对于临床和法医学筛查而言，全面表征一个样品，并理解典型化学谱图的定义方式是非常关键的，只有这样才可以识别出异常的峰。如果分析人员只对滥用药物的筛查有兴趣，可以使用更小的包括这些化合物的谱库可以用于筛查。但是， DoA 筛查非常复杂，对于获取某个样品的更完整化学性质非常有利，由此才可以得出结论，分析对象服用了哪些药物以及这些药物在人体内的存在时长。 表3.解卷积峰的总数以及与含8670个条目的普库中化合物匹配的峰数目。 样品 解卷积峰总数 匹配峰数 Urine A 824 169 Urine B 1523 223 Urine C 1574 263 Urine D 745 174 Urine E 1008 197 对于这六?(5个)企样品，匹配化合物列表可用于检索更需要关注的药物，这些 总结在表4中。根据 Maurer/Pfleger/Weber 谱库条目匹配和分子离子(若存在)以及其他碎片离子的精确质量数，自动识别这些化合物。除了质谱图中的精确质量数，我们可以将分子离子簇的同位素分布与理论分布进行匹配。例如，图4中，由于拉莫三嗪 2AC 的阳性结果，可以判断出尿液样品C 中存在抗惊厥药拉莫三嗪。测量的分子离子簇与理论值匹配度非常高，而且观测出每个同位素的准确质量数。这个匹配结果显示了尿液样品中该化合物存在的强有力证据。进一步的确证可以通过评估化学标准品的保留时间，尽管很多代谢物的认证标准品并没有市售的商品。在这样的情况下，精确质量数和同位素识别都是化合物识别的强大工具，这种方法的最大好处就是显著缩减了评估时间。 表4.六个尿液样品中迭代识别出化合物总结。 样品 化合物 基峰(m/z) HRF (%) 基峰质量数精度(ppm) 分子离子质量数精度(ppm) Urine A Cocaine 82.06512 100.0 1.5 — Methadone 72.08077 99.7 0.5 Morphine 268.1332 99.9 0.8 0.2 Paracetamol 109.05221 99.0 0.6 Urine B Tramadol 114.09134 99.7 0.8 Urine C Mirtazapine 195.09167 98.2 0.2 Lamotrigine 184.97935 100.0 0.4 0.3 Urine D Morphine 268.1332 96.7 0.8 0.2 Paracetamol 109.05221 98.9 0.9 0.5 Urine E Myristicin 180.07809 98.9 0.6 — Urine F Butyrfentanyl 146.09646 一 0.4 0.0 图4.拉莫三嗪 2AC 分子离子簇的测量值和理论值。每个同位素的元素分子式质量数精度均<1 ppm。 如上所述，当筛查尿液中药物时，目标化合物可能浓度很高或者很低。为了使筛查效率更高，并且避免假阴性结果，无论分析物浓度如何，检测系统必须提供同样出色的检测性能。实验证明 Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统在很宽的动态范 围内都能提供出色检测性能。图5显示的例子中，从 TIC中提取了对乙酰氨基酚和高香草酸峰。对乙酰氨基酚峰面积比高香草酸峰约高出三个数量级，但是两种化合物的质量数精度都保持了0.5 ppm 的高水准。 RT： 9.87-23.38 SM： 7B 15.64 图5.无论化合物浓度如何，质量数精度均小于 1 ppm。乙酰氨基酚(BP m/z 109.05221 下的质量数精度为0.5 ppm) 峰面积比高香草酸 ( BP m/z137.0597 下的质量数精度为 0.5 ppm ) 峰面积高出930倍。 Figure 6. Butyrfentanyl (C23H30N2O) El and PCl spectra at 12.77 minutes sample F. PCI data supports identification of parent with formulaabove with sub 1 ppm mass accuracy. El Fragments annotated with structures from MassFrontier 7.0. 在样品F中，数据解卷积后被识别的峰，但是没有匹配库中任何化合物。此峰的基峰离子 m/z 146.09643 7在在芬太尼型谱图中存在，因此可以快速排除 alpha 和 beta 甲基芬太尼，因为谱库中没有任何谱图匹配。El和 CI数据(图6)的精确质谱图用于识别 m/z 351.24309 的[M+H]+离子，所建议分子式为 C，HN，O， 质量数差值 0.03 ppm。这是非常关键的一步，出色的质量数精度可用于减少可能的化学分子式的数量。这个精度水平可以显著减少需要筛查的分子式数量，同时提高结果置信度。该化合物的建议分子式C，HN，O，使用在线化学数据库 ChemspiderTM 中检索该分子式，发现它可能是一个芬太尼的类似物，即butyrfentanyl。 这个芬太尼类似物在谱库中没有条目，因此没有匹配结果。最后，采用 MassFrontier7.0 对 butyrfentanyl 进行理论裂解，再将裂解结果与 El 和 Cl质谱图中小于1 ppm 的质量数精度的测量碎片进行匹配，确认了该识别结果。该质谱图可以被加入自定义谱库中用于以后的样品筛查。 ( 通过过滤这些峰(包括碎片 m/z 146.09647 和 189.13865) 的解卷积峰列表，快速识别了16个 butyrfentanyl 代谢物。 从CI 质谱图中识别出最大的代谢峰(保留时间14.4 min)，从[M+H]+离子推导出的 CHON 元素组成，质量数差值为0.8ppm。这可能是在所述的样品制备过程中，发生了一个乙酰化的氧化反应。b u tyrfentanyl 的代谢物也可以被加入筛查的质谱图库中。 ) Orbitrap 组学俱乐部 赛黑飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 全国服务热线：800 810 5118400 650 5118(支持手机用户) ( 本研究结果表明， Thermo Scientific Q E x active GC OrbitrapGC-MS/MS 系统结合 TraceFinder 软件是一个强大的分析工 具，可用于滥用药物的日常筛查以及复杂尿液样品分析。 ) ·Orbitrap 质谱仪为所有组分提供出色质量数精度，无论化合物浓度高低，提供快速准确的识别结果。 。使用独特的自动峰检测、质谱图解卷积以及化合物识别工作流程对六个尿液样品中的药物进行筛查。在样品中检测出多个药物。使用准确质量数信息，根据质谱图库匹配和碎片归属，识别出多个目标化合物。这个方法显著缩短了评估时间，并提供更加快速可靠的报告结果。 ·稳定的亚 1 ppm 质量数精度结合高灵敏度，使得样品中的已知和未知化合物识别结果非常可靠。使用准确的 EI/CI数据，可以推测样品F中存在 butyrfentanyl。 ( 。无论复杂基质中样品浓度高低，60，000 FWHM 的日常分辨率以及很宽的质谱图动态范围，实现复杂基质中的高选择性，消除同位素干扰，提高结果置信度。 ) ( 1 . 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