中药注射剂中急性毒性检测方案(水质毒性分析)

世界科学技术--中医药现代化★专题讨论：基于M icro tox技术的中药注射剂毒性早期发现与质量控制研究 2016 第十八卷 第十一期 ★Vol.18 No.11 基于Microtox 技术的中药注射剂毒性早期发现与质量控制技术研究进展* 赵军宁1**，鄢良春'，罗荔敏? (1.四川省中医药科学院国际转化医学中心、中药药理毒理研究所/国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室/中药品质评价与创新中药研究四川省重点实验室/四川省道地药材系统开发工程技术研究中心 成都610041；2.华润三九(雅安)药业有限公司 雅安 625000) 摘 要：Microtox 技术(即微毒技术)是测定环境中有害有毒物质生物毒性的一种方法，以非致病的发光细菌作为试验系，以其发光强度变化作为检测指标，日前已成为一种快速、简便的生物毒性检测手段。本文概述了本团队基于 Microtox 技术发展一种能够反映中药注射剂特点的早期、灵敏、快速、可靠的新技术平台和方法体系，探讨解决现有高风险中药注射剂生物评价及检测方法难以控制其风险的难题，实现高风险中药毒性参数的定量化表征，从而提高中药质量控制和安全性评价的可靠性。 关键词：中药注射剂 Microtox 技术 发光细菌 微小毒性 生物评价 doi：10.11842/wst.2016.11.015 中图分类号：R285 文献标识码： A 中药注射剂是指药材(饮片)经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。中药注射剂具有疗效确切、生物利用度高、作用迅速等特点，突破了中药传统的给药方式，功能较多地集中在清热解毒、活血化瘀和补益等11-4]方面，尤在抢救神志昏迷、不能口服的重症病人和急救等方面，可发挥着独特作用。与此同时，中药注射剂成分复杂、批间变异度大，风险可控性差，监测数据显示约90%的中药严重不良反应和预警信号涉及注射剂型。尽管目前国家食品药品监督管理总局(China Food and DrugAdministration， CFDA)对中药注射剂制定了近乎严苛的质量控制检测项目，但仍然难以高效发现与预 测中药注射剂的不良反应，尤其是生物学评价方法存在耗时、费钱、条件苛刻、可重复性低、与临床毒副反应不尽一致等问题，难以有效的保证其药效的一致性和降低其不良反应的发生率。鉴于中药注射剂复杂体系和现有测试方法尚难高效测试其综合毒性的现状，赵军宁研究团队基于 Microtox 技术开发了一种能够反映中药注射剂特点的早期、灵敏、快速、可靠的新技术平台和方法体系，探讨解决现有高风险中药注射剂生物评价及检测方法难以控制其风险的难题，实现高风险中药毒性参数的定量化表征，提高中药质量控制和安全性评价的可靠性。 1 Microtox 技术习 ( 收稿日期：2016-11-15 ) 发光细菌是一类在生理条件下能够发射波长 修回日期：2016-11-20 ( 科学技术部国家重点基础研究发展计划“973计划”2009CB522801)：有毒中药毒效学和靶器官毒作用规律研究，负责 人 ：赵军宁；科 学 技术部“重大新药创制”科技重大专项项目(20 1 5ZX09501004-001-005) ： 基于Microtox(微毒)测试的中药安全性快速检测、质量控制与风险预警新技术研究，负责人：赵军 宁 ；科学技术部“重 大 新药创制”科技重大专 项 项目(2011ZX09401-304)：成都生物医 药 产业创新孵化基地，负责人：赵军宁；科学技术部国家科技支撑计划项目(2012BAI29B10)：川产道地药材整合式全产业链技术集成与示范，负责人：赵军宁；国家自然科学基金委面上 项 目(81470180)： 基 于 Microtox 技术的中药毒性分级原理与标准研究，负责人：赵 军 宁；四川省科学技术厅科技支撑计划项目(2014SZ0135)：姜 黄 整合式全产业链综合开发研究，负责人：曾瑾。 ) ( ** 通讯作者：赵军 宁 ，本刊编委，研究员，博士，博士生导师，主要研究方向：中药药理(毒理)、中药质量生物控制、道地药药系统研究开发。 ) 450-490 nm可见荧光的阴兰阴性菌，该荧光属于冷光，在黑暗处肉眼可见。发光细菌分为海洋细菌和淡水细菌，海洋细菌包括发光杆菌属、希瓦氏菌属以及弧菌属中的大多数，淡水细菌有霍乱弧菌、青海弧菌等。 1.2 岁发光细菌代谢过程和原理 尽管发光细菌种类繁多，但其发光机理均属酶促氧化反应。参与细菌发光反应的主要物质包括黄素单核甘酸(Flavin Mononucleotide， FMN)、原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)(NAD(P)H)、荧光酶、分子氧、长链脂肪醛(RCHO)等。发光细菌所合成的荧光酶能够催化还原型黄素单核苷酸和长链脂肪醛，然后在氧的参与下发生氧化反应，产生的能量以光的形式释放8。发光的代谢过程和原理里图1。 发光细菌的发光强度在一定条件下是恒定的。当发光细菌接触到无机、有机毒物、抑菌、杀菌物等物质时，其细胞膜、酶、及细胞质的结构会发生改变，导致其发光强度发生改变。发光强度变化与接触物质毒性呈相关关系，毒性越强，发光抑制率越高。物质主要通过直接抑制参与发光反应的酶类活性及抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程两条途径抑制细菌发光。发光菌毒性测试是在20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性 的新方法10-12]。 2 适合于中药注射剂毒性快速检测的 Microtox 技术平台及应用 鉴于中药注射剂复杂体系和现有测试方法尚难高效、敏感、快速测试其综合毒性的现状，本团队在前期对 Microtox 技术测试研究工作基础上[5，13]，进一步发展能够反映中药注射剂特点的早期、灵敏、快速、可靠的安全性评价的新技术、新方法和新模型，提高中药注射剂质量控制和安全性评价生可靠性14-16]。 依托国家药品不良反应监测系统数据平台，在中药注射剂重点关注品种及其主要毒性风险信号、不良反应发生率研究基础上，探讨建立和完善中药注射剂等高风险品种的体外药物安全性评价替代模型、毒性预测及快速评价关键技术，系统研究中药注射剂对发光菌发光强度影响的药效-毒性效应谱、剂量-反应曲线和剂量-时间-反应关系，以毒性效应动力学过程、半数效量(ICso值)等综合指标，探索和阐明中药注射剂发光抑制毒性效应(体外试验)与毒性物质/成分、毒性作用和毒靶器官(活体试验)之间的内在规律，提出活血化瘀类、清热解毒类等中药注射剂毒性预测新技术及标准。客观比较微毒测试新方法评价结果与传统毒性评价方法及临床研究结果的差异，分析各方法的优势及不足；探讨新方法作为中药注射剂上市前风险检测评价指标的适用性，为高风险中药新药创制质量控制、风险预警和临床安全用药提供支撑。基本的思路与技术方案见图2. 图1 发光细菌发光的代谢过程及原理图I6.9] 注：E1，细菌荧光素酶；E2，NADH；E3，脂肪酸还原酶。 ( 1930 [ W orld Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and M a teria MedicaJ ) 图2 中药注射剂毒性快速评价关键技术研究技术路线图 [World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica]1931 2.1 质量控制 鱼腥草注射液在临床上应用已有几十年，详见《全国中医医院急诊科(室)必备中成药》。其不良反应存在多发、临床表现的多样、不可预知、不良反应种类的不确定、批与批之间不良反应存在差异性等特点。过敏反应、呼吸系统反应、心脑血管系统反应的构成比依次排在鱼腥草注射液不良反应的前3位。CFDA 暂停鱼腥草静脉注射液的使用，只批准肌内注射剂使用，并要求进行鱼腥草注射液(静脉注射)安全性再评价。鱼腥草注射液需要解决的关键问题包括：不良反应的产生原因、发生机制、可否通过干预措施避免等方面尚不明确。本团队以费氏弧菌作为测试菌种，探索将Microtox 技术应用于鱼腥草注射液综合毒性检测。通过方法学考察确定最优检测体系以及方法可靠性，在最优检测体系下，对3个批次鱼腥草注射液(成品)，3个批次鱼腥草注射液(半成品)以及2个批次鱼腥草注射液(溶媒)进行生物综合毒性检测。结果发现最优检测时间为 15 min，最优 pH 值是5.0-9.0，且15 min 发光强度以500-1000为宜；重复性试验和中间精密度试验的相对偏差均<15%；成品的 EC5o值分别为 51.62%、48.26%、41.69%，半成品的EC5o值分别为57.64%、54.26%、57.04%，显示鱼腥草注射液半成品的综合毒性均不同程度地小于鱼腥草注射液成品的生物毒性；溶媒100%浓度(同注射液中溶媒浓度，即2.5%的吐温80溶液)的抑制率分别为12.29%和7.97%，显示生物毒性均较小，几乎可认为无毒。故认为鱼腥草注射液对费氏弧菌的毒性存在显著的浓度-效应关系，故应用 Microtox 技术检测鱼腥草注射液综合毒性并用于控制其质量具有很好的应用前景117，18]。 2.2风险预警 红花注射液临床不良反应原因、机制相对明确，抗原活性杂质(蛋白)过敏反应，但无法用现有检验方法发现和预警。红花注射液有多个批次在全国部分地区出现高热、寒战为主的不良反应。经调查，不良反应的批号是同一批原料，在这批原料的前后，生产的产品都没有不良反应发生。产品经检验，符合红花注射液质量标准。经3个省药检所按质量标准检验也是合格的。我们的目的是探讨 Microtox 技术用于红花注射液质量控制，是否不良反应风险信号能在实验室得到预警?本团队以费氏弧菌为测试菌种，通过方法学考察确定最优检测体系及方法学可 靠性；在最优检测体系条件下，对不同生产厂家所生产的红花注射液进行发光菌综合毒性检测。结果发现在2mL反应体系下，最优复苏液体积0.9 mL/支菌，每个待测样品加入最优菌液体积 50 uL，最优检测时间10 min， 最优 pH范围5-10，且10 min 寸发光强度以 80-120万为宜；重复性试验、中间精密度试验的相对标准偏差均<15%；不同生产厂家A、B、C成品的EC50平均值分别为3.36%、5.58%、4.33%，具有显著性差异(P<0.05)。故得出红花注射液对费氏弧菌的毒性存在显著的浓度-效应关系，且不同生产厂家(包括原研单位在内)之间成品 EC50值具有显著性差异，提示红花注射液成品生物学检测标准存在进一步提升的空间，应用 Microtox 技术检测红花注射液综合毒性并用于控制不同厂家成品质量波动具有很好的应用前景1191。类似的结论在参麦注射液综合毒性检测、生脉注射液综合毒性检测均得到验证。 3 总结与展望 目前，物质毒性的常规检测对综合毒性的考虑较少，多以理化指标检测为主，而要明确对人类健康的影响，则必须用生物医学的方法对毒性进行分析，而传统的毒理学实验是以受试物的死亡进行判断，一般需要数天时间才会出结果，而且影响因素多、个体差异大，以致动物消耗量过多、测试结果在不同实验室波动较大。 3.11Microtox 技术特点 Microtox 技术应用于中药注射剂综合毒性的检测具有以下6个特点：①发光细菌与高等动物的物化特性和酶作用过程类似，凡能干扰或破坏发光细菌生长、呼吸、新陈代谢等生理生化过程的物质等都可以采用该方法进行生物毒性检测，故是一种综合毒性检测方法[20.21]，②方法国际公认，可靠、客观、快速，操作简单方便，结果重复性好；③对毒物反应灵敏，比一般细胞反应灵敏几个数量级；④试验所用的细菌数量大，多达数百万个，几乎可以忽略各体差异；⑤可以同时获得多个毒性参数，如：标准毒物参比值、IC5o、毒性剂量-效应动力学曲线等，既可以作为受试品毒效生物指纹图谱，又可以测试其毒性效能和效强，综合表征药物毒性特点；⑥特别适用中药注射剂、有毒中药[22，23]以及药物联合毒性作用的快速评价。 3.2 中药注射剂现状 近5年来，中药注射剂的复合增长率约为22.00%，与之前 30.00%的增长速度相比虽有所下降，但仍然高于中成药和整个药品市场的收入增长速度(分别为15.78%、18.23%)。目前，中国有303个企业具有134个中药注射剂品种1255个不同剂型规格的生产批文，其中常用品种有50多个。近年来随着中药注射剂临床应用的日益增加，不良反应发生也日趋增多。从2006年“鱼腥草事件”“葛根素事件”到2008年的“茵栀黄事件”“刺五加事件”再到2009年的“清开灵事件”和“双黄连事件”让中药注射剂行业陷入了信任危机。2006年后，国家对中药注射剂安全问题的关注达到了前所未有的高度。2009年7月，CFDA 为切实控制中药注射剂安全隐患，下发了《关于做好中药注射剂安全再评价工作的通知》，全面开展生产及质量控制环节的风险排查工作。目前，中药注射剂质量控制检测的项目包括：鉴别、性状、重金属、pH值、有关物质(蛋白质、鞣质、树酯、草酸盐、钾离子)、灼炽残渣、热原或细菌内毒素、装量、无菌、不溶性微粒、含量测定、可见异物、降压物质、过敏反应检查、异常毒性、溶血与凝聚、有害元素、渗透压、聚山山酯80、指纹图谱、5-HMF、大分子蛋白检查等。然而，这些检测项目仍然与有效保证其药效的一致性和降低其不良反应的发生率的目标有较大距离。 3.3 Microtox 技术应用于中药注射剂的前景展望 一般认为，中药注射剂临床不良反应主要归结为药物过敏反应和类过敏反应，其临床前致敏性的有效预测和致敏原控制的关键技术尚未得到解决。赵军宁团队认为，中药成分的复杂性、易变性和现时人们对其认知的程度决定了中药注射剂安全性问题是“综合毒性”问题，具有多成分、多靶点、多途径、低剂量、长时间、微毒性、综合毒的作用特征。可以说，以复方或者混合物入药的中药，大多具有典型的“微小毒性”和“综合毒性”特征，有必要发展新的、能有效预测和监控复杂中药的综合毒性的评价技术。赵军宁等[13，14]提出一种基于 Microtox 测试技术的快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法。红花注 射液、鱼腥草注射液等的试验数据，表明对于用传统方法检测合格的中药注射液，该发明方法可以测出其毒性差异，可以较好地解释现有中药注射液不良反应不一致的现象。。由此可见，中药注射剂综合毒性快速检测技术，即 Microtox 技术具有操作简单、检测速度快、准确度高反应灵敏等特点，可以检测中药注射液毒性的大小，亦可作为中药注射液质量控制的生物评价依据。在某些品种可采用 Microtox 技术，建立采用生物活性限值测定法(制定中药注射液对发光菌 IC50生物限值)，可以很好地预警在临床应用可能发生的不良反应。 目前该技术在中药及中药注射剂应用刚开始起步，尚不能完全区分中药的内在活性和外源性的毒性，可尝试开展该技术用于区分毒性物质和特异性毒性的研究，有必要扩大样本量、扩大研究范围、多部门跨领域多学科合作研究，对该技术进行更深入的研究，并探讨该技术评价结果与其他毒性评价方法及临床不良反应监测结果的一致性和关联性，基于 Microtox 技术的中药注射剂质量控制方法的标化与技术指导原则，适用于中药特点的定性定量参数表述；生物效价测定法和生物活性限值测定法的研究和完善，药品评价专用仪器开发等都是下一步需要解决的问题。2014年2月，由国家药品不良反应监测中心组织邀请全国药理毒理、药品检验、中药制剂、药品生产等领域的专家参会，讨论基于 Microtox技术的中药综合毒性快速评价技术在中药注射剂中应用的可行性及推广前景，专家一致认为Microtox技术在中药质量预警、毒性快速检测、质量评价等方面有较高的应用价值，值得进一步深入研究。进一步完善专门针对中药的 Microtox 技术体系，完成标准化检测，将可能是复杂成分中药质量控制、毒性快速检测、以及风险预警的重大突破。 ( 致谢： 本研究思路和方法的完善，得益于国家药品不良反应监测中心杜晓曦主任和宋海波博士等的大力 支持以及参加“基于 Microtox(微毒测试)的中药综 合毒性快速评价技术专家研讨会”各位专家的精彩发言，在此一并致以最诚挚的谢意! ) ( 陈翔宇，孙胜斌，冯玉康，等.基于黄酮类水平评价不同厂家舒血宁注射液的质量.世界科学技术-中医药现代化 ，2 016，18(6)：1056-1061. ) ( 2 王连心，谢雁鸣.基于文献 计 量分析的参麦注射液临床安全性评估.中国中药杂志，2012 ， 37(18)：2779-2781. ) ( 3关月.丹参-红花心脏保护及丹参-大黄肾脏保护的药效物质及作用机制研究.西安：第四军医大学博士学 位 论文，2015. ) ( 4 曹光军.脑供血不足应用丹参注射液与丹红注射液治疗的有效性 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Besides， we expounded the methods and stepwise technique map andaddressed key questions of microtox technology for the evaluation of the comprehensive toxicity of Chinesemedicinal materials. In conclusion， microtox technology is a promising method from a vantage point of the toxicitydetection of Chinese medicinal materials. Keywords： Traditional Chinese medical injections， microtox technology， luminous bacteria， toxicity， biological evaluation ( (责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷) ) [ World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica ] Microtox 技术（ 即微毒技术） 是测定环境中有害有毒物质生物毒性的一种方法，以非致病的发光细菌作为试验系，以其发光强度变化作为检测指标，日前已成为一种快速、简便的生物毒性检测手段。本文概述了本团队基于Microtox 技术发展一种能够反映中药注射剂特点的早期、灵敏、快速、可靠的新技术平台和方法体系，探讨解决现有高风险中药注射剂生物评价及检测方法难以控制其风险的难题，实现高风险中药毒性参数的定量化表征，从而提高中药质量控制和安全性评价的可靠性。