磺胺间二甲氧嘧啶中磺胺喹噁啉检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测磺胺类药物中的杂质 摘要：本文建立了使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测磺胺间二甲氧嘧啶中4个杂质(磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉)的方法。该方法使用非挥发性的磷酸缓冲盐对药物主成分和杂质进行了分离，并通过二维LCMS系统对目标杂质进行MS定性分析。该系统由于无需将非挥发性缓冲盐转换为挥发性缓冲盐，大大节省了方法开发人员的时间，并且保证了定性的准确度。 关键词： 磺胺间二甲氧嘧啶杂质2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统 有关物质检查是药品质量控制的重要内容。合成药物中的有关物质通常来源于合成原料，中间体和副反应产物。对于药物中的这些杂质(含量>0.1%)通常应进行鉴定。目前这些检查也是新药报批的必须项目。液质联用技术是药物杂质检测的不可或缺的手段。 世界各地药典的方法多是 LC 的方法，常常使用到磷酸盐、草酸盐等无机盐及这些盐类的缓冲溶液，甚至使用离子对试剂，以调节药物及杂质的保留时间。然而，非挥发性的缓冲盐作为流动相是无法应用到质谱中，因此，如果使用质谱对杂质进行定性，通常需要将非挥发性的缓冲盐换成挥发性的来进行。但是，更换过流动相后，杂质的保留时间往往会发生变化，这使得目标杂质的定位产生困难。 岛津公司为了应对该领域面临的问题，特推出了 2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统。使用该系统无需更换非挥发性缓冲盐的流动相，即可使用质谱仪(IT-TOF) 对目标杂质进行质谱分析。即保证了杂质定性的准确性又大大节省了方法开发人员的时间。 本文使用 2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测了磺胺间二甲氧嘧啶中的4个杂质。供相关人员参考。 1实验部分 1.1仪器 分析仪器： 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统，包括LC-20ADx4(输液泵)， SIL-20AC(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱)，CBM-20A(系统控制器)， DGU-20A5(在线脱气机)， SPD-M20A(二极管阵列检测器)， SPD-20A (UV检测器)，FCV-12AHx3(高压流路选择阀)，FCV-14AHx2 (色谱柱切换阀)， LCMS-IT-TOF(离子阱-飞行时间质谱)和LCMSsolution Ver.3.60(工作站)。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack VP-ODS， 4.6 mm I.D. ×150 mm， 5 pm 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 流动相：0.01 mol/L 磷酸缓冲盐(pH2.6))//MeOH (7/3，v/v) 流 速：1mL/min 柱 温：40℃ 进样体积：10uL 检测波长：200~350nm(检测：270nm) 色 谱柱： Shim-pack XR-ODS 2.0 mm I.D. ×75 mm， 2.2 um 流动相A： 0.1%FA 流动相B： MeOH 时间程序： 10%B(0 min) ~ 50%B (10 min)~ 10%B (10.01~20 min) 流 速：0.3mL/min 柱 温：40℃ 进样体积：：110 uL (Loop 环体积) 检测则长：270 nm 质谱条件 X 分析仪器： LCMS-IT-TOF 离子源： ESI(+)， ESI(-) 离子源接口电压：4.5kV 采集范围：100-1000 雾化气：氮气1.5L/min 干燥气：氮气10 L/min 碰撞气：氩气 脱溶剂管温度：200℃ 加热模块温度：：4200℃ 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 1.3系统流路图 图1.2D-LC-IT-TOF 的系统流路图 2DLC-IT-TOF系统分析过程： 1. 1stD 初始状态，药物样品进样，如图2所示。此配置与常规 LC一致，可将药典中的测试方法完全移植过来。此过程的一个重要目的在于确定目标杂质的保留时间。 2. 1stD 分别收集馏分(根据目标杂质的保留时间)到 loop 1，2，3，4，5(最大收集5个杂质组分，如需收集更多组分，需要更换更多位的高压阀，或者多次进样)，如图3和图4所示。Loop6的切换仅用作让 Valve C， D 的流时是顺时针变化，而不是逆时针回到初始位置，以免冲走 loop1~5中的馏分。 3. 2ndD分析，依次分析loop 6， 1， 2，3，4，5，共进行六次，如图5和图6所示。Loop6分析仅用于冲洗平衡管路，，不用于收集馏分。 4. 平衡1stD 流路，准备进行下一组分析。 5. 重复1到4的步骤，，只是进的样品变成了溶剂，得到空白数据。完整的批处理如图7所示。 6. 将得到的空白数据与药物进样时得到的数据进行比较，找出杂质峰，并使用 IT-TOF 得到的多级质谱信息解析杂质的结构。 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 图2.初始状态， 1stD分析 图3.在杂质洗脱下来前切换馏分环到制定位置，切换 RVL 到1位 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：4006165163 图4.当峰顶到达馏分环的中央时，RVL到0位，停止收集 图 5.2ndD 初始状态 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 图6. 2ndD馏分环中杂质被输送经过柱子分离后进质谱 图7.完整的批处理表 1.4样品制备 使用流动相配制主成分浓度为 500 pg/mL， 杂质浓度为 0.5 ug/mL。 本次实验涉及的标准品信息如下： 成分 中文名称 英文名称 分子式 分子量 CAS No. 主成分 磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine C12H14N4O4S 311.0809 122-11-2 杂质 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine CuH12N402S 265.0754 127-79-7 杂质 磺胺二甲基嘧啶 sulfamethazine/Sulfadimidine C12H14N402S 279.0910 57-68-1 杂质 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine C11H12N4O3S 281.0703 1220-83-3 杂质 磺胺喹噁啉 Sulfachinoxalin/Sulfaquinoxaline C14H12N402S 301.0754 59-40-5 2结果讨论 2.1 LC 1stD 分析结果 1stD 分析的主要目的为确定目标杂质的保留时间，以便于捕集到 LOOP环中，用于二维脱盐分析。本次实验 1stD 色谱图如下，主成分和4个杂质的出峰时间分别为：3.59 min， 4.60 min， 6.61 min， 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 17.82 min 和 14.65 min。 图 8.LC 1stD 分析色谱图 2.2 LC 2stD 分析结果 2.2.1杂质1的分析结果 杂质1切换到 LOOP 环1中， 经过 2D LC分析， 得到 UV 色谱图、MS 色谱图和质谱图如下。从 MS 质谱图可以看出杂质1正离子模式 m/z =265.0757，为磺胺甲基嘧啶，分子式CnH12N402S，理论值[M+H]+=265.0754，测试值与理论值偏差为1.13 ppm。使用自动二级功能得到磺胺甲基嘧啶的二级质谱图，质谱图如下所示。 2.2.2杂质2的分析结果 杂质2切换到 LOOP 环2中，经过2D LC分析，得到UV 色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从 MS质谱图可以看出杂质2正离子模式 m/z =279.0905，为磺胺二甲基嘧啶，分子式C12H14N4O2S，理 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 论值[M+H]+=279.0910，测试值与理论值偏差为-1.79ppm。使用自动二级功能得到磺胺二甲基嘧啶的二级质谱图，质谱图如下所示。 2.2.3杂质3的分析结果 杂质3切换到 LOOP 环3中，经过 2D LC分析，得到UV色谱图、MS 色谱图和质谱图如下。从MS质谱图可以看出杂质3正离子模式m/z =281.0706，为磺胺间甲氧嘧啶，分子式 C11H12N4O3S，理论值[M+H]+=281.0703，测试值与理论值偏差为 1.07 ppm。使用自动二级功能得到磺胺间甲氧嘧啶的二级质谱图，质谱图如下所示。 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 248.9876 MS 265.0190 2.2.4杂质4的分析结果 杂质4切换到LOOP 环4中，经过2D LC分析，得到 UV色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从 MS质谱图可以看出杂质4正离子模式 m/z =301.0752，为磺胺喹噁啉，分子式C14H12N402S，理论值[M+H]+=301.0754，测试值与理论值偏差为-0.66 ppm。使用自动二级功能得到磺胺喹噁啉的二级质谱图，质谱图如下所示。 3结论 本文建立了使用 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测磺胺间二甲氧嘧啶中的4个杂质的方法。该方法使用磷酸缓冲盐作为流动相对药物主成分和杂质的分离，并使用 IT-TOF 对目标杂质进行质谱分析。由于使用该系统保留了药典分析的方法，即保证了杂质定性的准确性，又大大节省了方法开发人员的时间。 色 谱 柱：Shim-pack VP-ODS, 4.6 mm × 150 mm, 5 μm流 动 相：0.01 mol/L 磷酸缓冲盐（pH 2.6）/ MeOH （7/3，v/v）流 速：1 mL/min柱 温：40 ℃进样体积：10 μL检测波长：200 ~ 350 nm（检测：270 nm）<LC 2ndD>色 谱 柱：Shim-pack XR-ODS 2.0 mm ×75 mm, 2.2 μm流动相A：0.1% FA流动相B：MeOH时间程序：10%B (0 min) ~ 50%B (10 min) ~ 10%B (10.01 ~ 20 min)流 速：0.3 mL/min柱 温：40 ℃进样体积：10 μL（Loop 环体积）检测波长：270 nm