牛奶中氯霉素检测方案(固相萃取仪)

Preekem 全自动固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法检测牛奶中的氯霉素 编号： ANIET1405 摘要：本方法参考《GB/T29688-2013牛奶中氯霉素残留量的测定》标准，建立了利用全自动固相萃取仪 (EXTRA)结合液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)检测氯霉素在牛奶中的残留量的方法。样品用乙酸乙酯提是，正己烷脱脂， C18柱净化，吹干转换溶剂定容后用相色谱串联质(HPLC/MS/MS)法测定，同时使用同位素内标进行定量分析，目标化合物的回收率和 RSD 均较好。本方法简便、灵敏、重现性好、干扰少、特异性好、能满足食品安全法规的需要。 关键词：氯霉素，牛奶， EXTRA， HPLC/MS/MS 引言： 氯霉素(chloramphcnicol，CAP)是由委内瑞拉链丝菌产生的抑菌性光谱抗生素，通过脂溶性可弥散进入细菌细胞内，抑制菌体蛋白合成，因此对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用，氯霉素是第一个可以人工合成的抗生素，因其抗菌范围广泛，已广泛用于动物各种传染疾病的治疗。氯霉素对人体有严重副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，而动物食品中氯霉素残留量会通过肉、蛋、奶等食物传递给人类，因此动物性食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了潜在的危害。许多国家和地区已禁止或限制氯霉素的使用，美国规定在动物食品中不得检出氯霉素：欧盟规定在动物源性食品中氯霉素残留量的最低极限值(MPRL)为 0.3ug/Kg；日本、韩国对我国出口的动物源性食品的氯霉素残留检测限要求达到 0.1ug/Kg； 我国农业部235号公告中也把氯霉素列为禁用药物。 本文参考《GB/T29688-2013 牛奶中氯霉素残留量的测定》标准，建立了利用全自动固相萃取仪(EXTRA)结合液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)检测氯霉素在牛奶中的残留量的方法。在提取完成后，选用 EXTRA全自动固相萃取仪，免人工干预，，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤，释放了大量实验室劳力。收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换定转后，以液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)完成了牛奶中氯霉素残留量的测定。本方法具有精确可靠、灵敏度高、重复性好以及降低假阳性检测结果的出现几率、节省分析时间和流动相的消耗量等优点，，可以满足准确、快速的检测需要，运用到实际样品的检测中结果令人满意。 1 试剂、仪器及器材 1.1试剂 除另外有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为一级水。 甲醇：液相色谱纯。 乙腈：液相色谱纯。 乙酸乙酯： AR. 正己烷： AR. 4%氯化钠溶液：称取4g氯化钠，加水溶解并稀释至100mL。 100ug/mL 氯霉素标准储备液：准确称取氯霉素标准品10mg，于 100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100ug/mL 的氯霉素标准储备液。-20℃以下保存，有效期1年。 100ug/mLd5氯霉素内标储备液：取d5氯霉素约10mg，精密称定，置100mL 容量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释成浓度为 100ug/mL。-20℃以下保存，有效期为1年。 100ug/L 氯霉素标准工作液：准确量确 100ug/mL 氯霉素标准储备液100uL， 于 100mL 的容量瓶中，用 50%乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 100ug/L 的氯霉素标准工作液。2-8℃保存，有效期3个月。 20ug/Lds氯霉素标准工作液：精密量取d5 氯霉素标准品 20uL， 于1000mL量瓶中，用50%乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为为 20ug/L 的氯霉素标准工作液。2-8℃保存，有效期3个月。 1.2仪器及器材 全自动固相萃取仪 EXTRA (上海屹尧)、Waters Alliance 2695 高效液相色谱-串联质谱仪、、超声波清洗仪、电子天平、超纯水机、高速离心机、氮吹仪、移液枪、C18色谱柱、C18小柱(500mg/6mL). 2实验方法 2.1提取 取试料10±0.05g，于 50mL 离心管中，加 500uL 内标工作液，再加乙酸乙酯20mL，振荡 15min， 6000r/min离心10min， 取乙酸乙酯层液于鸡心瓶中。再加乙酸乙酯20mL重复提取一次，合并两次提取液于鸡心瓶中，于45℃水浴旋转蒸发至干。用4%氯化钠溶液 5mL 溶解残留物，加正己烷 5mL 振荡混合1min， 静置分层，弃正己烷层。再加正己烷5mL， 重复提取一次。取下层液备用。 2.2净化 C18固相萃取柱依次用5mL 甲醇、5mL水活化，取备用液过柱，用5mL水淋洗，抽干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。 2.3分析 将洗脱液于50℃氮气浓缩至干。用 1.0mL50%乙腈溶解残余物，涡旋混匀，滤膜过滤后用 HPLC/MS/MS分析。 2.4仪器条件 2.4.1EXTRA净化程序 EXTRA 净化程序如表2所示： 表2 EXTRA 净化程序 动作 位置 溶剂 体积(mL) 抽溶剂速度 打溶剂速度 (mL/min) (mL/min) 清洗 外针 水 6 120 120 活化 甲醇 5 20 2 水 5 20 2 上样 样品溶液 5 20 1 空气 1 60 60 清洗 外针 水 6 120 120 稀释 水 5 20 15 上样 样品溶液 5 20 1.5 空气 1 60 60 淋洗 水 5 20 2 空气 8 60 60 洗脱 甲醇 6 20 1 空气 6 60 60 2.4.2 HPLC/MS/MS 条件 色谱条件：色谱柱：色谱柱： Ci8(2.1mm×150mm，5um， Waters)；流动相：乙腈+水(50：50)，用前过 0.45um滤膜，脱气；柱温：30℃；流速： 0.2mL/min；进样量：20uL；运行时间：3min。 质谱条件：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压： 2.8kV；离子源温度：120℃；雾化温度：350℃；碰撞气：气气3.0×10mbar；雾化气流速：450L/h；锥孔气速：50L/h；数据采集窗口： 3min；驻留时间：0.3s。定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压如表3所示： 表3定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压 名称 定性离子对m/z 定量离子对m/z 锥孔电压V 碰撞电压V 氯霉素 CAP 321/151.6 321/151.6 30 15 321/256.8 13 d5氯霉素 325.8/156.6 325.8/156.6 30 15 2.5标准曲线的制备 准确移取一定量的同位素内标储备液和混合标准中间液，配置如表4所示浓度混合系列溶液，进行HPLC/MS/MS分析，以峰面积与标准系列溶液浓度进行线性回归。 表4标准曲线浓度表 同位素内标 (ng/mL) 氯霉素标准品(ng/mL) 工作液浓度 20 104 10 0.52 10 1.3 3 10 2.6 4 10 5.2 5 10 10.4 3结果与讨论 3.1质谱与色谱行为 为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测模式进行检测，根据目前食品检测法规的要求，进行定性和定量分析。在选定的仪器条件下，混合标准溶液色谱图如图1所示，空白样品色谱图如图2所示，加标样品色谱图如图3所示： 图1标准溶液色谱图 图2空白样品色谱图 图3加标样品色谱图 由图中可以看出，各目标化合物的色谱保留时间重现性良好，样品经净化后，色谱分离行为良好。 3.2标准曲线回归方程 将混合标准系列溶液在2.4.2仪器条件下进样分析，以各组分浓度与其色谱峰面积进行线性回归。校准曲线及相关系数分别为 Y=3.78938*X+0.125219，R2=0.990962。 3.3加标回收率及精密度 在10±0.05空白样品中添加50uL 标准工作液，平行三份，进行加标回收实验。加标回收率、相对标准偏差如下表所示： 表5回收率及精密度实验结果 组分 本底值 加标值 平均测定值 RSD (n=3) 平均回收率 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) 氯霉素 0 5.2 4.71 4.25% 90.64% 3.4讨论 3.4.1质谱条件的选择 氯霉素分子式为 C11H12C12N2O5，有两个氯原子，具有较强电负性，在电喷雾源(ESI)中易失去一个电子而带负电荷，因此选择 ESI 负离子模式对其进行检测。其中分子中含有氯元素，因此同位素准分子离子峰分别为 m/z320.8和m/z325.6。对320.8的准分子离子进行二级质谱扫描，发现其碎片主要有121.0、151.8、175.9、194.0和256.8.本方法选取子离子151.8、175.9和256.8进行多反应监测(MRM)，以320.8/151.8 作为定量离子对，其它2个离子对作为定性离子对。 3.4.2色谱条件 氯霉素属于弱极性化合物，在水中溶解性较差，易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，本实验选用 50%乙腈溶液(乙腈/水(1：1))为流动相有利于 ESI 中溶剂去除，而且灵敏度和峰形都较好。 3.4.3样品检测结果 按照本文所述方法对实际样品进行分析，从上面3.1色谱图中可以看出，样品中的氯霉素很好地被分离，基本无干扰峰，且分析时间极短，只需 3min 即可完成一次分析。说明本方法用到实际样品检测中可以得到较好的分离分析结果。 4.结论 本方法采用乙酸乙酯对样品中氯霉素进行提取，全自动固相萃取进行样品净化，有效地去除了样品中的干扰成分，采用 HPLC/MS/MS 进行分析具有准确、快速、高灵敏度和高选择性的特点，能够适应大规模样品的快速分析。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 《 《GB/T29688-2013牛奶中氯霉素残留量的测定》 )