饮料中靛蓝检测方案(固相萃取仪)

Preekem 全自动固相萃取-高效液相色谱法检测测定饮料制品中的7种合成色素 编号：SUFET1401 摘要：本方法参考 《GB/T 5009.35-2003食品中合成着色剂的测定》标准，结合实际情况优化实验条件，用40℃的水提取饮料中的合成色素，然后用20%柠檬酸调 pH至6， 应用 EXTRA全自动固相萃取仪，使用聚酰胺柱分离、净化，淋洗液经浓缩、转换溶剂定容后，供HPLC-DAD检测，外标法定量分析。 关键词：：合成色素，柠檬黄，苋菜红，靛蓝，胭脂红，日落黄，诱惑红，亮蓝， EXTRA， HPLC 引言： 随着人们生活水平的提高，饮料在日常生活中越来越重要。现在市面上的饮料品种繁多，颜色也各种各样。但是很多饮料中大多都添加了人工合成色素，对人体有一定的毒害作用，由于长期食用会对人体健康产生一定的危害，我国《食品添加剂食用卫生标准》对它的使用范围和使用限量做出了严格规定，但个别企业并没有认真执行，违规添加合成色素的现象屡见不鲜。因此，建立一种快速、准确、灵敏的方法测定饮料中的合成着色剂，控制饮料质量具有非常重要的意义。 本文参考 《GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定》标准，结合实际情况优化实验条件，用40℃的水提取饮料中的合成色素，然后用20%柠檬酸调 pH至6，应用EXTRA 全自动固相萃取仪，使用聚酰胺柱分离、净化。。选用 EXTRA 全自动固相萃取仪，免人工干预，自动完成 SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤，释放了大量实验室劳力。收集液再经氮吹浓缩、溶剂转换定容后，以高效液相色谱仪(HPLC-DAD)完成了饮料中中柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝等7种合成色素含量的测定。 苋菜红 OH SONa 日落黄 靛蓝 1.试剂、仪器及器材 1.1试剂 甲醇(HPLC)： 经0.5um 滤膜过滤。 甲醇/甲酸(6：4)溶液：量取甲醇60mL，甲酸40mL， 混匀。 20%柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H8O7·H20)， 加水至100mL，溶解混匀。 乙醇/氨水/水(7：2：1)：量取无水乙醇 70mL，氨水 20mL， 水10mL，混匀。 乙酸胺溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL， 溶解，经0.45um 滤膜过滤。 1.2仪器及器材 全自动固相萃取仪 EXTRA (上海屹尧)、安捷伦1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、超声波清洗仪、电子天平、超纯水机、高速离心机、氮吹仪、移液枪、C18色谱柱(4.6X250mm，5um)、 聚酰胺小柱(500mg/3mL) 2.实验方法 2.1 提取 果汁类样品： 方法一：称取1g(精确到0.01g)样品于50mL离心管中，加水稀释至10mL40℃水混匀，用20%柠檬酸溶液调 pH值到6. 方法二：称取1g(精确到0.01g)样品于 50mL 离心管中，加入1mL 乙酸锌和 1mL亚铁氰化钾，混匀，再加水稀释至10mL40℃水混匀， 5000r/min 离心 3min， 取上清液用20%柠檬酸溶液调 pH值到6. 汽水或含酒精类样品： 称取lg(精确到0.01g)样品于 50mL 离心管中，加水稀释至 10mL40℃水混匀，加热去除二氧化碳或酒精后，用20%柠檬酸溶液调 pH 值到6。 2.2净化 5mL水活化→上样→8mL甲醇/甲酸(6：4)淋洗→8mL水淋洗 8mL 乙醇/氨水/水(7：2：1)洗脱 2.3分析 洗脱液在80℃下氮吹至干，用水定容至1mL， 经0.45um滤膜过滤后用 HPLC分析。 2.4仪器条件 2.4.1EXTRA净化程序 EXTRA 净化程序如表1所示： 表1 EXTRA净化程序 动作 位置 溶剂 体积(mL) 抽溶剂速度 (mL/min) 打溶剂速度 (mL/min) 清洗 外针 水 6 120 120 活化 水 5 20 2 上样 样品溶液 5 20 2 清洗 外针 水 6 120 120 稀释 水 5 20 15 上样 样品溶液 5 20 2 空气 0.5 60 60 甲醇/甲酸(6：4) 8 20 5 淋洗 水 8 20 5 空气 8 60 60 洗脱 乙醇/氨水/水(7：2：1) 8 20 2 2.4.2色谱条件 进样量：10uL；柱温：35℃；流速：1.0mL/min，检测波长范围及梯度洗脱程序分别如表2、表3所示： 表2 DAD 检测波长范围 时间(min) 设定值(nm) 参考值(nm) 0 450 800 2.3 560 800 3.5 516 800 4.7 620 800 5.4 530 800 6.8 560 800 表 3 HPLC梯度洗脱程序 时间(min) 甲醇% 0.02mol/L 乙酸铵溶液% 0 10 90 3 65 35 6 98 2 2.5标准曲线 移取一定量的三种色素标准储备液配置如表4所示浓度混合系列溶液，进行高效液相色谱分析，以峰面积与标准系列溶液浓度进行线性回归。 表4标准曲线浓度表 苋菜红 胭脂红 诱惑红 柠檬黄 靛蓝 日落黄 亮蓝 储备液浓度 (mg/mL) 1.03 0.500 1.016 0.999 0.550 1.018 0.500 1(mg/mL) 0.00824 0.0206 0.008128 0.007992 0.0088 0.008128 0.004 2 (mg/mL) 0.0206 0.01 0.02032 0.01998 0.022 0.02036 0.01 3(mg/mL) 0.02884 0.014 0.028448 0.027972 0.0308 0.028504 0.014 4(mg/mL) 0.0412 0.02 0.04064 0.03996 0.044 0.04072 0.02 3.结果与讨论 3.1色谱图 通过高效液相色谱分离，利用 DAD 检测器检测，在2.4.2色谱条件下，标准溶液、加标样品和空白样品的色谱图如下所示： 图3果汁(加乙酸锌和亚铁氰化铵后稀释)空白样品、加标样品、混标色谱图 图4果汁(直接稀释)空白样品、加标样品、混标色谱图 图5汽水类样品(美年达)空白样品、加标样品、混标色谱图 由图中可以看出，7种人工合成色素保留时间重现性良好，样品经净化后无明显干扰。 3.2标准曲线回归方程 将混合标准系列溶液在2.4.2色谱条件下进样分析，以混合系列标准溶液浓度为横坐标(Area)， 以相应峰面积为纵坐标(Amt)进行线性回归。回归方程及相关系数如下表所示： 表4标准曲线回归方程及相关系数 组分 回归方程 相关系数 柠檬黄 Area=31398.8318*Amt+0.9920026 0.99997 苋菜红 Area=30550.8316*Amt+3.1085856 0.99999 靛蓝 Area=27821.3048*Amt-7.8794578 0.99881 胭脂红 Area=29576.7432*Amt+1.8647016 0.99998 日落黄 Area=32181.0987*Amt+2.7224202 0.99998 诱惑红 Area=39381.5732*Amt-3.2976384 0.99998 亮蓝 Area=99526.3295*Amt+2.7359565 0.99997 3.3加标回收率、相对标准偏差 在1.0g空白样品中添加适量三种色素的标准混合液，平行三份，进行加标回收实验。加标回收率、相对标准偏差如下表所示： 表5回收率及精密度实验结果 种类 组分 本底值 加标值 平均测定值 RSD (n=3) 平均回收率% (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) 柠檬黄 0 0.00999 0.00866 0.08 86.69 果汁(加 苋菜红 0 0.01030 0.00855 2.24 83.01 入乙酸锌 靛蓝 0 0.01100 0.00741 2.49 67.36 和亚铁氰 胭脂红 0 0.00500 0.00425 0.87 85.00 化钾后稀 日落黄 0 0.01018 0.00862 0.84 84.68 释) 诱惑红 0 0.01016 0.00637 2.14 62.70 亮蓝 0 0.00500 0.00381 1.70 76.20 柠檬黄 0 0.00999 0.00962 3.68 96.30 苋菜红 0 0.01030 0.00861 2.76 83.59 果汁(直 靛蓝 0 0.01100 0.00552 0.16 50.18 胭脂红 0 0.00500 0.00429 1.50 85.80 接稀释) 日落黄 0 0.01018 0.00922 1.24 90.57 诱惑红 0 0.01016 0.00867 0.49 85.33 亮蓝 0 0.00500 0.00390 0.55 78.00 柠檬黄 0.00710 0.007992 0.01549 4.33 104.98 苋菜红 0 0.00824 0.00659 1.39 79.97 汽水类 靛蓝 0 0.00880 0.00667 1.27 75.80 (美年 胭脂红 0 0.00400 0.00329 4.58 82.25 达) 日落黄 0.02039 0.008144 0.02908 6.08 106.7 诱惑红 0 0.008128 0.00705 2.85 86.74 亮蓝 0 0.00400 0.00361 2.88 90.25 3.4讨论 3.5.1本方法适用于大批量样品的同时检测，样品量大，所以本实验采用了EXTRA 全自动固相萃取仪进行净化处理，免人工干预，自动完成SPE 柱活化、样品上样、目标物洗脱和收集等步骤。全自动固相萃取仪采用正压技术控制液体流速，保证液体传送的准确性和重现性，从而避免了重复的人工操作及人为误差， 并且能够确保良好的重现性和精确性，便于方法的实验室间转移，也便于建立行业乃至国家的实验室标准。 3.5.2果汁类样品由于油脂、蛋白质、淀粉、糖含量较高溶液较粘稠，所以本文中用两种方法进行前处理，-种方法用温水稀释时同时加入乙酸锌和亚铁氰化铵沉淀蛋白，另-种方法是直接用温水稀释。由实验结果可知，两种方法实验回收率都较好，符合回收率测定要求，因而可以根据样品粘稠程度选择合适的前处理方法。 3.5.3由于靛蓝对柠檬酸、酒石酸及碱不稳定，而本实验中使用到柠檬酸及碱，所以本实验中靛蓝回收率相对较低且不稳定。 3.5.4净化前调pH至酸性时，所选用的酸不能对聚酰胺柱子产生影响。本文做过实验比对，用甲酸和20%柠檬酸调 pH 后进行净化时发现，用甲酸调pH 至酸性的样品上样时色素在小柱上扩散很严重，上样还未完成时已经扩散至柱子底端，并且用甲醇/甲酸(6：4)进行淋洗除杂时，会有少量色素被洗出。而用20%柠檬酸调节pH至酸性的样品上样时未发生扩散，仍在柱子顶端。 4.结论 本实验采用全自动固相萃取仪结合高效液相色谱法同时检测饮料中的7种人工合成色素：苋菜红、胭脂红、诱惑红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝。该方法抗干扰性强，具有较高的灵敏度，回收率符合要求，精密度 RSD 值也都较小。因此本方法能同时检测饮料中7种合成色素，对市售饮料起到很好的筛查作用。 ( 参考文献 ) ( [1] GB/T 5009.35-2003《食品中着色剂的测定》 )