亚甲基蓝与酵母核糖核酸中电化学研究检测方案(电化学工作站)

Vol. 19.No. 10Oct.，2007化学研究与应用Chem ical Research and Application第19卷第10期2007年10月 1159廖等：亚甲基蓝与酵母核糖核酸相互作用的电化学研究第10期 文章编号：1004-1656(2007)10-1158-04 亚甲基蓝与酵母核糖核酸相互作用的电化学研究 廖 纺，朱清涛，何晓英，艾 珍，蔡铎昌 (西华师范大学化学化工学院完 四川 南充 637002) 关键词：酵母核糖核酸；亚甲基蓝；循环伏安法；电化学检测 中图分类号：O657 文献标识码：A 亚甲基蓝(methylene blue， MB)是一种具有平面结构(结构式见图1)的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，可用于亚硝酸盐、黄氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。电分析化学中常被用作氧化还原指示剂或电子媒介体，其在水溶液中的电化学行为曾被深入地研究11-21。。在水溶液中，MB的还原态为无色中性分子，而氧化态MB 为一价阳离子，由于分子中环平面和氮杂原子上甲基的存在而具有一定的疏水性。水溶液中 MB容易形成二聚体，在电极上发生两个连续的1电子转移反应(EE mechanism)，其氧化还原电位的峰距AEp介于1电子转移反应(59mV)和2电子转移反应(28.5mV)之间。以MB 为分子探针来研究其他生物大分子已有很多报道13-9]，如近年来发现MB对DNA具有插入作用[8-9]，可被用于抗癌药物的体外筛选，但对于 RNA的研究目前还没有文献报道。 图1 MB分子的结构式 Fig.1 The structure ofMB 核酸是所有生物的基本遗传物质，核酸与靶向小分子的相互作用是核酸研究的重要课题之一，从生物学和临床科学的角度来说研究小分子与核酸的相互作用，对于认识核酸的生物活性以 及药物作用机理有重要意义。近几年来，报道了利用某些染料如乙基紫、灿烂绿、中性红等作为标记物测定核酸10-12]。本文采用循环伏安法和紫外-可见光谱法探讨了亚甲基蓝与酵母核糖核酸(yRNA)的相互作用，建立了一种间接检测 yRNA的电化学方法。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LK98BⅡ微机电化学分析系统(天津市兰力科化学电子高科技有限公司)；紫外-可见分光光度计 (UV2550分光光度计日本岛津)；三电极系统：玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极(以下报道的电位皆相对于此电极)，铂片电极为对电极。 酵母核糖核酸(中国科学院生物化学研究所)；亚甲基蓝(分析纯)，其他试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。所有的测量溶液均是含1.0 ×10 mol/L的 MB或 1.0 x10 mol/L的MB+不同浓度的 yRNA的 CH，COOH -CH，COONa缓冲溶液。 1.2 实验方法 玻碳电极()为4mm)首先用2000目金相砂纸、0.05umA10；抛光粉抛光成镜面，然后分别在1：1的 HNO3、1：1的 NaOH和丙酮中超声清洗1m in，最后用二次蒸馏水冲洗，红外灯下烘干。 取一定体积识pHI=5.6的 CH，COOH-CH，COONa缓冲溶液通氮除氧10min，电位扫描区间在-1.0V~0.5V之间，用循环伏安法活化电 ( 收稿日期：2006-12-12；修回日期：2007-05-19 ) ( 联系人简介：何晓英(1956-)，女，副教授，主要研究方向：电化学及其应用. Email： hexysctc@ yahoo. com. cn ) 极，然后取一定体积亚甲基蓝标准溶液，在一定电势扫描速度下记录循环伏安曲线。所有实验均在(25±1)℃下进行。 紫外吸收的波长范围为200~800mm，分辨率为2mm。 2 结果与讨论 2.1 MB的电化学研究 0.4 图2 1.0 ×10mol/L的 MB在 pH=5.6CH COOH- CH COONa溶液的循环伏安图 Fig.2 Cyclic volatmmogram of 1.0 ×10 mol/L MB inCH， COOH - CH， COONa buffer solution (pH=5.6) 图3 MB峰电位(a)和峰电流(b)与pH的关系 Fig.3 The relationship of potential(a) and current(b)ofMB and pH 2.1.1 MB的循环伏安图 图2为 1.0 ×10'mol/L 的NMB在 H1三=5.6的CH， COOH-CH， COONa缓冲溶液中，扫描速度为50mV/s时玻碳电极上的循环伏安曲线。在曲线中可观察到1对氧化还原峰，其氧化峰和还原峰峰电位分别为-0.099V和 -0.153V，峰电位差差Ep 为 54mV，氧化峰和还原峰电流基本相等，氧化还原式量电 位 E=-126mV，表明MB在裸玻碳电极上的电极反应为准可逆的两电子过程，与文献报道的两电子的EE过程相符，这可能由于亚甲基蓝在溶液中容易形成二分子聚集体，因而往往以二聚体的形式发生反应。 2.1.2 溶液的 pH值对MB电化学反应的影响 图3为 CH， COOH - CH，COONa缓冲溶液中，pH值在2.6-6.5范围内，在玻碳电极上MB氧化峰电位和峰电流与 pH值的关系。当 pH从 2.6逐渐增加到6.5的过程中，氧化峰电位随 pH值的增加以65mV/pH的速率向负方向移动(图3a)，其线性方程为： Epaa=0.2495- 0.0652pH，相关系数为0.9943。表明质子参加了 MB的氧化过程，且参加反应的质子数与电子数相等都为2131。 0.4 图4 MB与 yRNA相互作用的循环伏安图 Fig 4 Cyclic voltammogram of interactions between MB and yRNA in pH=5.6CH，COOH- CH， COONabuffer solution(a) 1.0 ×10mol/LMB (b) 1.0 ×10 mol/LMB+0.5mg/mL yRNA 2.2 MB与 yRNA相互作用的电化学研究 2.2.1 MB与yRNA相互作用的循环伏安曲线 采用循环伏安法对 MB与 yRNA相互作用进行研究(见图4)。曲线a表示11.0 x10~mol/L的 MB的循环伏安曲线(实验条件同图2)，曲线b为1.0x10mol/L的MB +0.5mg/mL的 yRNA在 pH=5.6的 CH， COOH-CH，COONa缓冲液中的循环伏安曲线，其峰电位电别为 -0.100V和 -0.167V，峰电位差为67mV，氧化还原式量电位E= -134mV。比较曲线a和b，当MB溶液中存在yRNA时，图中并没有产生新的氧化还原峰，只是MB的氧化还原峰电流均大大降低，而氧化还原式电位略有移动，这表明MB与 yRNA分子发生了较强的相互作用，该作用方式为静电作用。 2.2.2 扫描速度对MB与 yRNA相互作用的电化学行为的影响 MB和MB-yRNA在玻碳电极上的循环伏安实验表明 MB的峰电流(a)与扫描速 度(v)有关。实验结果见图5和6，曲线a表示溶液中不含 yRNA，曲线b表示溶液中含有 yRNA。当v在 0.01~0.5V/s时，无论 yRNA存在与否，h与v的关系均呈一向下弯曲的曲线，而与v'成正比。表明MB和MB-yRNA的电极氧化过程均为扩散过程14] 图5 MB峰电流与扫描速率的关系 Fig 5 Effect of scan rate on the peak current(a) no yRNA (b) yRNA in presence in MBsolution (scan rate： 0.01V/s~5V/s) 图6 MB峰电流与扫描速率的平方根的关系 Fig 6 The variation of peak current ofMB with squareroot of scan rate (a) no yRNA (b) yRNA in presence inMB solution ( scan rate：0.01V/s~5V/s) 2.3 MB与 yRNA相互作用的紫外-可见光谱研究 图7为 CH， COOH - CH， COONa缓冲溶液 (pH=5.6)中 1.0×10mol/L的MB单独存在时(曲线 a)和1.0 ×10mol/L的 MB和不同浓度的yRNA(曲线 b、c浓度依次降低)同时存在时的紫外-可见吸收光谱图。从该图可以观察到MB单 独存在时，在200-800mm之间，有4个吸收峰，分别位于 680mm、610nm、290mm和246mm。而在MB与 yRNA共存的液液光谱图中，相应的吸收峰也位于这四处，其峰位没有发生变化，只是随着yRNA浓度的增加，680mm、610nm、290mm处的吸收峰强度越来越低，而246mm处的吸收峰随着yRNA浓度的增加，吸收峰强度越来越高。这是由于 yRNA在 246mm左右处也有吸收峰，因此其吸收峰强度随着yRNA 浓度的增加而增加，而680nm、610mm、290mm处的吸收峰则是由于 MB与yRNA发生了相互作用，吸收峰强度随着yRNA浓度的增加而降低。紫外-可见吸收光谱结果表明在 pH=5.6的 CH， COOH -CH， COONa缓冲溶液中，MB与 yRNA的相互作用方式为静电作用，这与电化学方法的结果一致。 图7 MB与 yRNA相互作用的紫外光谱图 Fig 7 The UV-V is spectro scop ic of the interactionbetweenMB and yRNA 图8 MB 峰电流的降低值与 yRNA浓度的关系 Fig8 The relationship between concentration ofyRNA and the decrease of peak current ofMB 2.4 yRNA的电化学检测 当MB的浓度为1.0 ×10mol/L时，其氧化 峰电流的减小值△与所加入 yRNA的浓度在5.0×10 mg/mL-3.0 ×10 mg/mL范围内呈线性关系，如图8所示，线性回归方程为△为a(uA)=-77.24+1.770 X10 c(mg/mL)，线性相关系数为0.9976。 综上所述，亚甲基蓝能够在裸玻碳电极上实现其直接电化学反应，且在裸玻碳电极上具有强的吸附性。电化学和紫外-可见吸收光谱方法的研究都表明，在 pH= 5.6的 CH，COOHH- ( 参考文献： ) ( [1] Zutic V， S v etlicic V ， L o vric M ， et al. 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Inter f acial Eletrochen . 1979 . 101 ： 19~28 ) Electrochem ical study on the interaction betweenm ethylene blue and yea st RNA Liao Fang， Zhu Qing-tao， He Xiao-ying， Ai Zhen，CaiDuo - chang (College of Chem ical Engineering， China West Nommal University， Nanchong， SiChuan， 637002) Abstract： The interaction between methylene blue (MB) and yeast RNA (yRNA) was studied by the cyclic voltammetry. Theinteraction was also testified by the UV- visual absop tion spectrum. The result indicated that the interaction ofMB and yRNA waselectrostatic action in the CH，COOH - CH，COONa buffer solution (pH=5.6). And with the increase of the concentration ofyRNA， the absoiption peak intensity was weaker and weaker. An indirect electroanalytical method for detem ining yRNA wasdeveloped. The m inished peak currents ofMB were proportional to the concentration of yRNA in the range of 5. 0 ×10 mg/mL-3.0X10 mg/mL， and the linear regression coefficient was 0. 9976. Key words：methylene blue； yeast RNA； cyclic voltammetry； electroanalytical chem istry ( (责任编辑 张文华) ) @ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net