大黄酚和牛血清蛋白中相互作用的电化学性质检测方案(电化学工作站)

佳木斯大学学报(自然科学版)Journal of Jiamusi University (Natural Science Edition)第26卷第6期2008 年11月Vo1.26 No.6Nov. 2008 第6期李玉敏：大黄酚和牛血清蛋白相互作用的电化学性质研究863 文章编号：1008-1402(2008)06-0862-03 大黄酚和牛血清蛋白相互作用的电化学性质研究① 李玉敏 (佳木斯第八中学，黑龙江佳木斯154005) 摘 要： 在pH4.0的 Britton-Robinson(B-R)缓冲体系中，应用循环伏安法和示差脉冲伏安法对大黄酚与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的电化学性质进行研究.结果表明，二者结合生成了一种非电活性的超分子化合物，同时对结合反应的机理进行了探讨.BSA的存在导致大黄酚氧化还原峰电流降低，峰电位基本不变，峰电流的下降值同所加入的BSA浓度在一定范围内呈线性关系.线性范围5.0 ×10 mol/L~1.0 ×10 mol/L，检出限3×10mol/L. 关键词： 大黄酚；牛血清白蛋白；电化学 中图分类号： 0657.1；Q512.1 文献标识码： A 0 引 言 血清白蛋白是血浆中含量很高的重要载体蛋白质，在一定条件下，药物分子与蛋白质之间可通过分子间作用力形成超分子化合物，它是生命科学和化学之间的一个边缘性研究内容-31.因此考察蛋白质与药物分子的相互作用，对阐明生物大分子与小分子配体间相互作用机理和规律具有重要的意义4]. 这种超分子化合物与小分子配体本身相比在电化学和光谱性质上有明显的变化，以此为基础建立许多蛋白质的分析方法，但文献报道多以光谱法为检测方法.电分析化学法具有简单、快捷、高灵敏度和高选择性等特点，为蛋白质的生物电化学研究提供了重要的研究方法.大黄酚是中药大黄中的一种有效成分，属于蒽醌类衍生物，具有电化学氧化还原性质，对大黄酚与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的研究尚未见报道.本文主要研究在酸性B-R缓冲溶液中大黄酚与BSA 相互作用的电化学性质，大黄酚修饰电极可望作为蛋白质的电化学探针用于蛋白质的测定. 实验部分 1.1 仪器与试剂 LK2005 电化学工作站(天津市兰力科化学电 ( ① 收稿日期：2008-10-29 ) 子高科技有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PB-20 标准型pH计(德国赛多利斯股份公司)；三电极系统：玻碳电极(GCE)为工作电极饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极. 大黄酚(emodin)(中国药品生物制品检定所)，5.0×10mol/L，使用时再进行稀释；牛血清白蛋白(BSA)(北京奥博星生物技术责任有限公司)，相对分子质量以65000计，1.0 ×10mol/L，4℃冰箱保存；Britton- Robinson (B-R)系列缓冲液；高纯N2 (99.99%)；实验所用试剂均为A.R及，水为石英亚沸二次蒸馏水. 1.2 实验方法 电极预处理：先用小号金相砂纸将玻碳电极磨光滑，再用0.05um的α-Al2O；悬糊液抛光成镜面，依次用乙醇和水超声清洗，用氮气吹干备用. 以pH4.0B-R缓冲液为支持电解质，加入适量的大黄酚与牛血清白蛋白，与未加BSA的大黄酚溶液比较，用循环伏安法、示差脉冲伏安法和紫外光谱法对该体系进行研究和测定.进行电化学实验时须向溶液中通入高纯N除氧，测定过程中溶液上方保持N气氛. 2 结果与讨论 2.1 大黄酚与BSA 作用的循环伏安法 在pH4.0的B-R缓冲液中，在5.0×10mol/L的大黄酚溶液中，当加入BSA的浓度为5.0X10 mol/L时，在电位扫描范围内未出现新峰，氧化还原峰电流均下降，而峰电位基本不变.且随着BSA浓度的增加，峰电流的降低值随之增加.说明大黄酚和BSA结合形成没有电化学活性的超分子化合物，使溶液中游离的大黄酚浓度下降，对应氧化还原峰电流下降，如图1所示. 图1 大黄酚与BSA 作用的循环伏安图 (a)CBsA=0 ； (b) cBSA =5.0 ×10mol/L 2.2 大黄酚与BSA作用差分脉冲伏安法 差分脉冲伏安法(Diferential Pulse Voltammetry，DPV)可提高灵敏度和选择性，我们采用 DPV 法研究大黄酚与BSA 相互作用的电化学行为.如图2所示，大黄酚在pH4.0的B-R缓冲液中，产生一个灵敏的还原峰，峰电位为-0.459V.在溶液中加入一定量的 BSA后还原峰电位几乎不变，而峰电流大大降低，峰电流的降低值同加入的BSA量在一定范围内呈线性性系，其线性回归方程为：AIp=-780) + 506 C，r=0.9987(AIp 为大黄酚与大黄酚和BSA化合物电流的差值，单位mA；C为BSA的浓度，单位 mol/L)检出限为3×10ml/L.对5×10mol/L 的 BSA进行7次平行测定 ，RSD=3%，因而可望用于BSA的定量测定. 图2 大黄酚与不同浓度 BSA 作用的差分脉冲伏安图 (a)CBsA=0.625 ×10mol/L；(b)cBsA=1.250 ×10-‘mol/L；(c)cBsA=2.500 ×10ml/L 2.3 参与电极反应的电子数、质子数和电极反应标准速率常数计算 式中，为电量，S为峰面积，u为扫描速度，「为吸附量. 电极反应电子数可由(1)，(2)和(3)式求得，大黄酚的电极反应电子数为2.大黄酚与 BSA 相互作用后，应用同样的方法计算大黄酚的电极反应过程电子转移数也为2. 固定大黄酚和BSA的浓度，改变B-R缓冲溶液的pH值，以相应pH值的大黄酚溶液作参比，考察溶液酸度对加入BSA 后大黄酚峰电流和峰电位的影响.结果表明pH值的大小对两者相互作用有较大的影响，pH4.0时二者峰电流有最大的差值，相互作用最强，因此实验选取pH4.0的B-R缓冲溶液.在不同pH条件下，引入BSA后的循环伏安图有共同特点，即在扫描电位范围内均未出现新峰，峰电位基本不变，而峰电流却有不同程度的降低.随着溶液pH值的增大，峰电位E负移，其线性回归方程为： E，， =-0.1421-0.0615pH，r=0.9985，由2.3方法计算得电极反应质子为2. 考察峰电位随扫描速度的变化，可以计算电极反应的电荷转移系数α和表面电极反应标准速率常数k1. 当nAE， > 200mV时， 分别将还原峰电位 E氧化峰电位E对扫描速度的对数logv作图，可获得两条直线，由直线的斜率求得α值.k，由(6)公式计算： logk， = olog(1-a)+(1-a)loga 文献「8]对于大多数反应体系，α值在0.3~0.7之间.本实验计算得到的α值与文献相符. 通过实验和计算发现大黄酚的电极反应过程电子转移数和质子数均为2，没有变化.大黄酚与BSA作用前后电极反应的电荷转移系数α分别为 0.60和0.45.表面电极反应标准速率常数k，分别为0.45和0.21.说明无论BSA是否存在，大黄酚的电极反应没有变化，只是体系游离的大黄酚浓度降低，使峰电流降低. 2.4 机理探讨 由于 BSA 的空间结构由三个结构域组成，每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒的内部，构成疏水性腔.研究表明，对大黄酚体系中是否加入BSA对其电化学参数无显著的影响.因此进一步推测大黄酚与BSA 作用后形成了一种非电活性的超分子化合物，大黄酚进入BSA圆筒内，BSA分中中的疏水性氨基酸残基进入大黄酚的蒽环结构，由于BSA 的包埋使得大黄酚的电化学活性基团隐藏于BSA 内部而不易在电极上发生氧化还原反应，导致大黄酚的氧化还原峰电流降低. 3 结 论 大黄酚与BSA相互作用前后电极反应过程电子转移数、质子数和表面电极反应标准速率常数等电化学参数均未发生显著变化.并且发现作用前后循环伏安曲线的形状基本不变，只是相应的峰电流有所下降.表明大黄酚与BSA 相互作用形成非电 化学活性的超分子化合物，使氧化还原反应的峰电流下降.大黄酚修饰电极可作为蛋白质的电化学探针用于蛋白质的测定. 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Ana l Biochem . 2005，342(10)：229-236 . ) ( [4] 孙伟，焦奎，刘晓云.电化学法研究蛋白质和茜素红S的相互 作用[J]，分析化学研究简报，2002，30(3)：312-31 4 . ) ( [5] 王海人，肖忠柏，宋功武，等.荧光素与牛血清蛋白作用的光 谱研究与分析应用[J].分析测试学报，2001，20(4)：45-46. ) ( [6] 王敬政，贺吉香，江崇球.芦荟大黄素与血清白蛋白的相互作 用[J].分析化学研究简报，2001，29(7)：782-78 4 . ) ( [7] 董绍俊，车广礼，谢远武.化学修饰电极(第二版)[M].北京 ： 科学出版社，2003，373-382. ) ( [8] 张祖训，汪尔康.电化学原理和方法[M].北京：科学出版社， 2000，32-33. ) Electrochemical Study of the Interaction bet ween Emodin and BSA LIYu-min (No.8 Middle School ， Jia musi 154005，China) Abstract： In pH 4. 0 Britton-Robinson(B - R) buffer solution， electrochemical of the interaction betweenemodin and bovine serum albumin (BSA) was studied by using cyclic voltammetry(CV) and differential pulse voltammetry (DPV). The results showed that emodin and bovine serum protein generated a electrochemical inactive super-molecular compound. At the same time ， the combined reaction mechanism was discussed. The redox peak current ofemodin decreased and the electric potential changed little as a result of the presence of BSA. The relationship betweenthe peak current decline and the concentration of BSA was linear in the range of 5.0 ×106~1.0 ×10 'mol/L， andthe detection limit was 3 ×10 mol/L. Key words：)： emodin： bovine serum albumin： electrochemistry ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved http：//www.cnki.net