桂枝茯苓胶囊中 芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量中在线二维液相色谱法检测方案(液相色谱仪)

中国中药杂志China Journal of Chinese Materia Medica第38卷第23期2013年12月Vol. 38，Issue 23December， 2013 在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量 张艳海，张大伟2，孟兆青3.4，刘绿叶1，金燕1* (1.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海201203； 2.黑龙江省农垦总局总医院，黑龙江哈尔滨150088； 3.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港222001；4. 中国药科大学，江苏南京210009) [摘要] 使用双梯度液相色谱系统和紫外检测器，建立在线二维液相色谱方法，同时测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量。采用双梯度液相色谱的其中1个泵为一维分离泵，以乙腈为有机相，0.08%磷酸+0.08%三乙胺为水相，梯度洗脱，采用 Cg色谱柱(3.0mm×150 mm，3 um)，流速0.5mL·min；利用双梯度液相色谱的另外1个泵为二维分离泵，以乙腈为有机相，以20 mmol，pH 3.0 的磷酸二氢钾为水相，梯度洗脱，采用 PAⅡCis色谱色(4.6mm×150 mm，3um)，流速0.8 mL· min；检测波长218，230，275 nm，采用波长切换方式。芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的线性范围分别为 5.55~222，6.6~264，3.3~132，0.315~12.6 mg·L-l；r分别为0.999 7，0.999 5，0.999 8，0.999 7；4个成分的平均回收率在96.12%~103.9%。该方法快速，测定结果准确可靠，可用于评价药物质量。 [关键词] 二维液相色谱；双梯度液相色谱；桂枝茯苓胶囊；苦杏仁苷；肉桂酸 高效液相色谱已成为中药复杂体系研究的重要技术，随着新型色谱柱填料和键合技术的发展，为中药中各类成分的分离提供了多种选择，然而中药的复杂性已远远超出了人们的设想， Davis等1曾经指出用一维分离方法对含有100个随机组分的样品进行分离，完全分离82个组分，至少需要400万的理论板数，且当色谱峰的数量超过峰容量的37%时，系统的分离度会大大降低，所以在现有技术条件下，期望如此高的柱效和峰容量是不切实际的。多维液相色谱分离是液相色谱发展的一个重要方向，它是将多种不同分离机制的色谱体系进行联用，增加了色谱系统的分离能力，扩大了分离空间，提高了系统的峰容量，可以满足复杂样品的分离要求。在多维色谱分离手段中，二维分离最为常见。二维色谱根据一维组分是否直接进入到第二维进行分离可分为离线[24]和在线[5-6]2类，其中在线方法具有自动化程度高、避免人为误差及加快样品分析效率等优点， ( [收稿日期] 2013-04-18 ) ( [通信作者] *金 燕 ，Tel：(021 ) 5895 7 001， E-mail： yan. jin @ ther-mofisher. com ) ( [作者简介] 张艳海，硕士，从事色谱分析工作，E- m ail： yan- hai882002@ yahoo. c om. cn ) 二维液相色谱分离技术已被越来越多的应用到中药的研究中7-91。 桂枝茯苓胶囊系汉代张仲景《金匮要略》古方桂枝茯苓丸的改进剂型，经现代制造工艺精制而成为纯中药制剂，由桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓组成。在2010年版《中国药典》中收载的桂枝茯苓胶囊含量测定项下分别采用3种高效液相色谱法测定丹皮酚、芍药苷和苦杏仁苷的含量110，不仅实际样品的分析效率较低，且缺乏来自桂枝中的指标性成分。本文利用双梯度高效液相系统(dual gradient liquidchromatography，DGLC)在线二维色谱分离技术，样品提取后，溶液直接进样分析，并同时测定了肉桂酸的含量，含量测定结果与原方法基本一致，且样品分析效率大大提升，可用于桂枝茯苓胶囊的质量分析。 材料 双三元液相色谱 RS 系统(美国赛默飞世尔公司)，配置6通道真空脱气机 SRD3600，双梯度分析型色谱泵 DGP3600RS，自动进样器 WPS3000TSL，柱温箱 TCC-3000(配有1个六通阀和1个十通阀)，二极管阵列检测器DAD3000RS，变色龙色谱管理软件Chromeleon 6.8 SR11； Acclaim PAⅡ (4.6 mm×150mm，3 um，美国赛默飞世尔公司，批号 063191)； Ac- claim C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，3 um，美国赛默飞世尔公司，批号063691)。 磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(色谱级，Fisher 公司)；去离子水(18.2MQ，Millipore)；丹皮酚对照品(paeonol，纯度96.8%，供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号110821-201112)；芍药苷(peniflorin，纯度>98%，上海安谱，STA-07013001)；苦杏仁苷( amygda-loside，纯度>99%，上海安谱，STA-20107007)；肉桂酸(cinnamic acid，纯度>99%，上海安谱， STA-43200000)。桂枝茯苓胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，产品批号110625，110626，110730)。 2 方法和结果 2.1 色谱条件 一维分析泵的流动相A 为乙腈，流动相B为0.08%磷酸+0.08%三乙胺， Acclaim120 Cig为一维分析柱，流速为 0.5 mL· min，梯度洗脱，0~10min，15%A，10~25 min，15%~75%A，25~30 min，75%~85%A，30~33 min，85% A，33 ~35 min，85%~15%A；二维分析泵的流动相A为乙腈，流动相B为20 mmol，pH 3.0的磷酸二氢钾，Ac-claim PAⅡ Cig为二维分析柱，梯度洗脱程序，0~5min，5%A，5~15 min，5%~40%A，15~15.2 min，40%~5% A， 15.2~20 min，5% A， 20~30 min，5%~70%A，30~35 min，70% A，流速0.8 mL·min-，柱温35℃，检测波长0~10 min，230 nm，10~15 min，218 nm，15~35 min，275 nm，进样量5uL。 2.2 对照品溶液的制备分别精密称取肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚对照品适量，按照2010年版《中国药典》桂枝茯苓胶囊项下对照品溶液制备方法，制得各对照品质量浓度分别为0.63，1.11，0.66，1.32g·L。 2.3 样品溶液的制备 取桂枝茯苓胶囊10粒，将内容物至研钵中研匀，取细粉约0.25 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取 30 min，放冷，再称定质量，补重，摇匀，滤过，取续滤液适量，即得。 2.4 专属性试验分别取缺少桂枝、桃仁、白芍和牡丹皮的阴性制剂，按照2.3项下方法制备阴性样品。按照上述色谱条件进样分析，对照品、样品、阴性样品的分离谱图见图1~3。从阴性样品叠加谱图可以看出，不干扰目标物的测定，方法专属性较好。 其中，0~10 min 为一维色谱分离过程，波长230 nm；10~15 min 为二维色谱分离过程，波长218nm；15~25 min 为一维色谱分离过程，波长 275 nm；25~35 min 为二维色谱分离过程，波长为275 nm。 图 混合对照品分离谱图 Fig. 1 图2 桂枝茯苓胶囊分离谱图 Fig. 2 2.4 线性关系考察 分别取各对照品溶液2mL(肉桂酸对照品200u.L)至10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，作为混合对照溶液1，再分别从对照品溶液1中精密量取5.0，2.5，1.0，0.5，0.25mL 至10mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件进样分析，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚分别在0.315~12.6，5.55~222.0，3.3~132，6.6~264 mg·L-线性关系良好，r分别为0.999 7，0.999 7，0.999 8，0.999 5。 2.5 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样5次，结果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面积的 RSD 分别为0.33%，0.51%，0.39%，0. 64% 2.6 稳定性试验 取待测样品溶液，分别于配制后0，2，4，6，10，12 h 进样，测定待测成分的峰面积，结 果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面积的 RSD 分别为1.4%，0.45%，1.1%，0.46%。 2.7 重复性试验取同一批号的桂枝茯苓胶囊样品粉末5份，每份0.25g，精密称定。按照样品溶液制备方法制备样品，按照上述色谱条件进行测定，结果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚含量的 表1芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂酸的加样回收率 RSD 分别为0.39%，0.65%，0.68%，0.78%。 2.8 加样回收率试验 取已知含量的样品6份，每份0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂酸对照品溶液适量，按照供试品溶液制备方法制备样品并测定含量，计算回收率，结果见表1。 Table 1 成分 样品中量/mg 加入量/mg 则得值/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 芍药苷 1.560 1.220 2.790 100.2 99.07 1.8 1.590 1.220 2.810 99.95 1.610 1.550 3.130 97.82 1.530 1.550 3.070 99.35 1.570 1.780 3.280 96.12 1.520 1.780 3.320 101.0 苦杏仁苷 0.920 0.730 1.640 98.74 98.24 1.4 0.940 0.730 1.670 101.0 0.950 0.920 1.850 98.27 0.900 0.920 1.790 96.78 0.920 0.860 1.760 97.35 0.900 0.860 1.740 97.67 丹皮酚 0.730 0.530 1.250 97.75 99.68 2.9 0.740 0.530 1.280 101.4 0.750 0.660 1.440 103.9 0.710 0.660 1.380 100.8 0.730 0.790 1.510 98.18 0.710 0.790 1.470 96.08 肉桂酸 0.018 1 0.0126 0.0306 99.21 97.21 1.3 0.018 4 0.012 6 0.0308 98.33 0.0186 0.0189 0.036 9 96.83 0.0177 0.0189 0.035 8 95.71 0.018 2 0.0252 0.0426 96.83 0.0176 0.025 2 0.041 9 96.34 2.9)含量测定取批号为110730，110625，110626的桂枝茯苓胶囊 0.25 g，精密称定，按照样品前处理方法制备样品溶液，分别采用本法与药典方法测定，结果见表2。 3 讨论 3.1 分析流路构建 样品中芍药苷与丹皮酚的含量较高，样品基质成分干扰较少，利用一维色谱进行分离，而苦杏仁苷与肉桂酸的含量较低，受到基质成分干扰影响较大，因此采用中心切割的二维分离方法，将2种成分分别切至二维色谱中进行分离。为避免在切换转移过程中系统压力的骤然变化对色谱柱造成的影响，试验中采用定量环储存样品。为减 表2桂枝茯苓胶囊中芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂酸的质量分数(n=2) 批号 分析方法 芍药苷苦杏仁苷丹皮酚 肉桂酸 110625 本法 14.94 8.77 7.27 0.174 药典方法 14.89 9.23 7.22 110626 本法 14.85 8.72 7.25 0.172 药典方法 14.80 9.24 7.33 110730 本法 15.12 8.89 7.06 0.175 药典方法 15.18 9.30 7.13 少一维溶剂效应的影响，试验中采用300 uL的定量 环，并尽量减小一维色谱柱的柱体积。同时在一维和二维色谱柱的柱后通过1个六通阀实现了检测器 的共用，使方法更具普适性。整个系统流路和阀切换过程见图4和表3。 图44在线二维柱切换系统流路连接示意图 Fig.4 表3 阀切换过程 Table 3 阀切换时间/min 右阀位置 左阀位置 说明 0 10-1 6-1 一维色谱柱与 UV 相连，用于芍药苷的测定 3.5 1-2 6-1 将苦杏仁苷切换至 loop 中 4.0 10-1 6-1 转移结束，一维色谱柱继续分离芍药苷 10.0 10-1 1-2 芍药苷分离结束，二维色谱柱与 UV 连接，分析测定苦杏仁苷 15.0 10-1 6-1 苦杏仁苷分离结束 19.0 1-2 6-1 将肉桂酸转移至loop 环 19.5 10-1 6-1 一维色谱柱与 UV 连接，分析测定丹皮酚 25.0 10-1 1-2 二维色谱柱与UV 连接，测定肉桂酸 变化对二维分离造成的影响。 3.3 含量测定结果比较比较样品的含量测定结果发现，芍药苷、丹皮酚的含量基本一致，但苦杏仁苷的含量差异较大(本法较药典方法低近5%)。本文首先对比了采用药典方法和本法的样品谱图中苦杏仁苷色谱峰的 UV 光谱均匀性，结果二者基本一致，且光谱均匀性均较好，无法通过 UV 二极管阵列检测器来判断方法的专属性。因此本文采用二维分离手段，在常规药典方法基础上，将苦杏仁苷峰的主体中心切割至第二维色谱柱中进行分离，结果见图5，由于一维和二维色谱柱存在分离选择性的差异，结果在同样检测波长下，在二维分离的谱图中可见明显杂质峰(R，=16.953min)，说明常规药典的分离手段存在基质干扰。因而造成了最后的含量测定结果偏高。 3.2 色谱条件确定 本文为实现一维和二维分离选择的正交性，在色谱柱选择上先后尝试了 PFP+Ci8，PFP+PA Ⅱ C18，Ci8 +PA Ⅱ Cig等组合，最终确定Ci8 + PA Ⅱ C1g组合(柱选择性对比函数 Fs=6111)。可获得良好的峰形和分离度；在流动相选择上，试验中曾尝试在一维和二维分离中的有机相分别采用甲醇和乙腈，但由于苦杏仁苷与肉桂酸的色谱峰在一维分离过程中峰宽较大，切割过程中可能会造成损失，若一维分离的有机相也采用乙腈，则2种成分的峰宽较小，且与二维色谱流动相相溶性较好。在水相选择上，本文为使芍药苷和丹皮酚在一维分离过程中获得良好的峰形和分离度，选择了0.08%磷酸系统，并加入了0.08%的三乙胺，而二维水相中加入磷酸缓冲盐，可以减少一维溶剂 pH 图5 桂枝茯苓胶囊二维分离谱图 Fig.5 4 结论 中药成分较为复杂，理化性质差异较大且结构类似的化合物较多，因此谱峰重叠现象较常见。通过系统的方法学验证，表明本试验所建立二维色谱分析方法，简便快速，自动化程度高，且可同时进行桂枝茯苓胶囊中4种成分的含量测定。利用一维和二维色谱柱分离机制的差异，提高了系统的分离能力，消除了基质成分的干扰，测定结果更加准确，对提高分析效率，控制药物质量具有一定意义。 ( [参考文献] ) ( [1 ] Davis J M ， Giddings J C . Statistical t heory of c omponent ov e rlap in multi-component [ J]. Chromatograms Anal Chem， 1983， 55(3)：418. ) ( [2] 邹萍，王绍艳，张志强，等 . 二维高效液相色谱技术用于分析中药制剂中的麻黄类生物碱[J].分 析 测试学报，2007，26 ) ( (1)：120. ) ( [ 3] Venkatramani C J， Z elechonok Y. T w o-dimensional li q uid c h ro- matography with mixed mode st a tionary phases[J ] . J Ch r omatogr A，2005，1066：47. ) ( [ 4 ] Reyes L H ， Encinar J R ，Marchante-Gayon J M， et al . S el eniumbioaccessibility assessment i n selenized yeast after “ in vitro”gas-trointestinal digestion using two-dimensional c hromatography an d mass spectrometr y [J ] . J Chromatogr A， 2006，1110：108. ) ( 「 51 Li Yi， Gao Jian-Ping，Xu X u，et a l . S imultaneous d e termination o f baicalin，rhein and b erberine i n r at plasma b y co lumn-switchinghigh-performance liqui d chromatography [ J] . J Chromatogr B ， 2006，838：50. ) ( [ 6 ] Xiao-liang Cheng，Li-ping Guo，Zai-quan Li，e t a l . An HPLC method for simultaneous determination of 5-aminoimidazole-4-carboxamider i boside a nd its a ctive metabolite 5 -aminoimidazole-4-carboxamide ri- botide in tumor-bearing nude m ice p l asma a n d it s application t o pharmacokinetics study J ] . J Chromatogr B，2013(915/916)：64. ) ( [ 7] Hu L H， Chen X G ， Kong L，et al. Im p roved performance of co m -pre h ensive t wo-dimensional HPLC separation of traditional Chi- nese m edicines by using a silica monolithic column and n o rmali- zation of peak height s [ J ] . J Chromatogr A，2005，1092(2)： 1 9 1. ) ( [ 8 ] Tian H Z ， Xu J，Xu Y ， e t a l . Multidimensional l i quid chromatog-raphy system with an innovative so l vent ev a poration int e rface[J].J Chromatogr A，2006，1137(1) ： 42. ) ( [ 9 ] Ma C F， Wang H H ， Lu X，et al. An a lysis of Artemisia annua L. volatile oil by comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry [J ] . J Chromatogr A，2007，1150 (1/2)：50. ) ( [ 10] 中国药典.一部[S].2010：984. ) ( [ 11] L R Snyder，J W D olan，P W Ca r r. T h e h y drophobic-subtraction model o f reversed-phase column selectivity [ J ] . J Chromatogr A ， 2004，1060：77. ) Rapid determination of four components in Guizhi Fuling capsule withonline two-dimensional liquid chromatography ZHANG Yan-hai'， ZHANG Da-wei， MENG Zhao-qing4， LIU Lv-ye， JIN Yan* (1. Thermo Fisher Scientific Inc.， Shanghai 201203， China； 2. Heilongjiang Agricultural Reclamation General Hospital， Harbin 150088， China；3. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. ， Ltd.， Lianyungang 222001， China； 4..(China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China) Abstract|TTo establish the online two-dimensional liquid chromatography by using double gradient liquid chromatography sys-tem and UV detector， in order to simultaneously determine the content of paeoniflorin， paenol， amygdaloside and cinnamic acid. Apump of the two-dimensional liquid chromatography was adopted as the one-dimensional separation pump. Ci8 (3.0 mm×150 mm，3um) was used as the analytical column， with acetonitrile as the organic phase and 0.08% phosphoric acid+0.08% triethylamine asthe aqueous phase for gradient elution at the flow rate of 0.5 mL·min. Another pump of the two-dimensional liquid chromatographywas adopted as the two-dimensional separation pump. PA Ⅱ Ci was used as the analytical column， with acetonitrile as the organic phaseand 20 mmol，pH 3.0 monopotassium phosphate as the aqueous phase for gradient elution at the flow rate of0.8 mL· min. The de-tection wavelengths were set at 218， 230， 275 nm by using wavelength time-switching program. The linearity range of paeoniflorin，amygdaloside， paeonol and cinnamic acid were 5.55-222(r=0.999 7)， 3.3-132(r=0.999 8)，6.6-264(r=0.999 5) and 315-12.6 mg·L(r=0.999 7)， respectively. The average recoveries of the four components were between 96.12% and 103.9%. Theexperiment proved that this method was so rapid and accurate in determination results that it could be used for evaluating drug quality. [Key words_ two-dimensional liquid chromatography； double gradient liquid chromatography； Guizhi Fuling capsule； amygdal-oside； cinnamic acid doi：10.4268/cjcmm201319?? ( [责任编辑 曹阳阳] )       桂枝茯苓胶囊系汉代张仲景《金匮要略》古方桂枝茯苓丸的改进剂型，经现代制造工艺精制而成为纯中药制剂，由桂枝、牡丹皮、桃仁、芍和茯苓组成。在２０１０年版《中国药典》中收载的桂枝茯苓胶囊含量测定项下分别采用３种高效液相色谱法测定丹皮酚、芍药苷和苦杏仁苷的含量［１０］，不仅实际样品的分析效率较低，且缺乏来自桂枝中的指标性成分。本文利用双梯度高效液相系，在线二维色谱分离技术，样品提取后，溶液直接进样分析，并同时测定了肉桂酸的含量，含量测定结果与原方法基本一致，且样品分析效率大大提升，可用于桂枝茯苓胶囊的质量分析。