食品中诱惑红检测方案(液相色谱仪)

2 4 食品中9种合成色素同时检测的方法 郭丽萍李仁勇金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：液相色谱；紫外； Acclaim PA； Waters OASIS WAX；果味水；配制酒；果丹皮；果冻；泡泡糖；橡皮糖；柠檬黄；新红；苋菜红；靛蓝；胭脂红；日落黄；诱惑红；亮蓝；赤藓红； Key words： HPLC；UV detection； Acclaim PA； Waters OASIS WAX；Fruit water； Imitation wine； Candied fruit； Jelly； Bubble gum； Chewing gum；Tartrazine； New red； Amaranth； Indigo； Carmine； Sunset yellow； Fancy red；Brilliant blue； Erythrosine； 引言 在食品加工过程中，为求得食品色泽艳丽或保持原有色泽，增进人们食欲并提高食用价值，往往需要添加着色剂。食用着色剂是使食品着色和改善食品色泽的物质，通常有食用合成色素和食用天然色素两大类。食用合成色素主要指用人工化学合成方法所制得的有机化合物，我国允许使用并使用较多的合成色素有：日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红、亮蓝、靛蓝。由于合成色素一般较天然色素色彩鲜艳、坚牢度大、性能稳定、易于着色并可任意调色、成本低廉、使用方便，近年来，随着食品工业的发展，合成色素在食品加工和储藏中的应用越来越广泛。现在国家出台的相关规定，促使食用色素生产商更加严格规范化，用量和使用范围受到严格限制。 测试条件 仪器： Ultimate 3000系统；包括：带在线脱气单元的四元梯度泵，自动进样器，带有一个六通阀的柱温箱，多通道紫外检测器。 分析柱： Acclaim PA(5um， 250 mmx4.6mm)； 保护柱： Acclaim PA (5um， 10mmx4.3mm)； ； 柱温：25℃； 检测波长：见表1； 进样量：10pL； 淋洗液组成、流充及梯度：见表2； 表2.淋洗液组成、流速及梯度 时间 A(CH，CN) B(20mM NHOAc 流速 (min) (%) 水溶液)(%) (mL/min) 0 10 90 1 5 25 75 1 8 70 30 1 11 70 30 1 12 10 90 1 18 10 90 1 样品前处理果味水 称取适量样品，超声除去二氧化碳，取2.0g超声后的样品，加适量甲酸调节PH至4-6，上WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL2%的甲酸水溶液活化)，以2%甲酸清洗，弃去全部流出液，最后以5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩，定容至2mL，高速离心后，取上清液进行上机测试。 配制酒 称取适量样品，超声并加热除去乙醇，称取2.0g，取2.0g超声后的样品，加适量甲酸调节PH至4-6，上WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL 2%的甲酸水溶液活化)，以2%甲酸清洗，弃去全部流出液，最后以5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩，定容至2mL，高速离心后，取上清液进行上机测试。 表1.9种色素的检测波长 色素名称 柠檬黄 新红 苋菜红 靛蓝 胭脂红 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 检测波长(nm) 428 509 521 608 509 483 509 625 529 将样品研碎或切碎，称取1g，加8mL热水(约100℃)，振荡提取10min，离心，收集上清液，沉淀加无水乙醇-氨水(80mL乙醇+1mL氨水，定容至100mL)2-3mL， 加热振荡提取10min，离心，取上清液，沉淀重复用氨水乙醇提取、离心2次，合并上清液，加冰醋酸调节PH至2， 转移至WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL 2%的甲酸水溶液活化)，以2%甲酸清洗，弃去全部流出液，最后以5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩，定容至2mL，高速离心后，取上清液进行上机测试。 图3.苹果味水在428nm的吸收谱图 标准溶液分离谱图 图1.9种色素混标在428nm的吸收谱图(浓度各位10mg/L) 图4.绿冰酒在428nm的吸收谱图 样品分离谱图 图2.橙味水在428nm的吸收谱图 图5.果丹皮在428nm的吸收谱图 图6.橡皮糖在428nm的吸收谱图 图7.泡泡糖在428nm的吸收谱图 图8.果冻在428nm的吸收谱图 样品测定结果(见表3) 表3.样品测定数据 样品 柠檬黄 新红 苋菜红 胭脂红 靛蓝 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 橙味水 测定浓度(mg/L) 10.81 --- --- 1.64 13.86 --- --- --- 原样浓度(mg/L) 10.81 --- --- 1.64 --- 13.86 --- --- -- 苹果水 测定浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.507 --- 原样浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.507 --- 绿冰酒 测定浓度(mg/L) 6.83 --- --- --- --- --- --- 0.89 --- 原样浓度(mg/L) 6.83 --- --- --- --- --- --- 0.89 --- 果丹皮 测定浓度(mg/L) --- --- --- 5.25 --- --- --- --- --- 原样浓度(mg/L) --- --- --- 5.25 --- --- --- --- --- 橡皮糖 测定浓度(mg/L) --- --- --- --- --- --- 48.9 --- --- 原样浓度(mg/L) --- --- --- --- 48.9 --- --- 泡泡糖 测定浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 --- 原样浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 --- 果冻 测定浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 原样浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 加标回收实验 取浓度各为25 mg/L的混合标准溶液0.8mL，添加到2g样品中，相当于原样加标10mg/L，经前处理后，进行测定。测定加标回收率见表4。 检测限和定量限 以3倍噪音峰高为检测限，10倍噪音峰高为定量限，为0.4mg/L的谱图为标准谱图，获得标准溶液峰高和基线噪音，检测方法最低检测限和定量限见表5。 标准工作曲线 选0.4、1、3、5、10 mg/L5个浓度混标做标准曲线，结果如表6. 表5.方法检测线和定量限 组分 检测限(mg/L) 定量限(mg/L) 柠檬黄 0.6 2 新红 0.7 2.1 苋菜红 0.9 3 胭脂红 0.8 2.7 靛蓝 0.6 2.0 日落黄 0.5 1.5 诱惑红 0.5 1.7 亮蓝 0.12 0.4 赤藓红 0.5 1.6 表4.加标回收率数据 样品 柠檬黄 新红 苋菜红 胭脂红 靛蓝 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 加标样品(mg/L) 22.02 9.68 9.68 8.91 11.81 25.6 9.57 9.56 6.72 橙味水 样品浓度(mg/L) 10.81 --- --- --- 1.64 13.86 --- --- --- 回收率(%) 112.1 96.80 96.80 89.10 101.6 117.4 95.70 95.60 67.20 加标样品(mg/L) 18.9 9.49 9.53 9.06 9.25 9.41 9.49 10.10 10.30 苹果水 样品浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.51 --- 样品浓度(mg/L) 107.9 94.90 95.30 90.60 92.50 94.14 94.93 95.90 103.0 加标样品(mg/L) 18.11 9.83 9.72 9.22 9.52 9.54 9.61 9.36 9.97 绿冰酒 样品浓度(mg/L) 6.83 --- --一 --- --- --- --- 0.89 --- 回收率(%) 112.8 98.30 97.20 92.20 95.20 95.40 96.10 84.70 99.70 加标样品(mg/L) 8.736 9.133 8.96 6.417 22.18 9.026 9.008 8.683 8.065 果丹皮 样品浓度(mg/L) --- --- --- --- 10.47 --- --- 回收率(%) 87.36 91.33 89.60 64.17 117.1 90.26 90.08 86.83 80.65 加标样品(mg/L) 27.78 9.196 9.27 8.317 8.832 40.19 14.31 9.285 7.752 橡皮糖 样品浓度(mg/L) 18.06 --- ---一 --- 0.2635 28.53 4.579 --- --- 回收率(%) 97.20 91.96 92.70 83.17 85.68 116.7 97.31 92.85 77.52 加标样品(mg/L) 12.67 7.724 8.284 8.125 7.913 8.260 10.74 11.42 6.031 泡泡糖 样品浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 0 回收率(%) 92.50 77.24 82.84 81.25 79.13 82.60 98.20 110.5 60.31 加标样品(mg/L) 11.56 10.50 10.49 11.96 10.24 10.91 10.44 10.59 8.670 果冻 样品浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 回收率(%) 108.4 105.0 104.9 119.6 102.4 109.1 104.4 105.9 86.70 表6.标准曲线数据 Peak Name Cal. Type Points Coeff. Det. Offset Slope 柠檬黄 LOff 5 99.9966 -0.0327 0.5015 新红 LOff 5 99.8282 -0.0007 0.4128 苋菜红 LOff 5 99.9785 -0.0516 0.2962 靛蓝 LOff 5 99.8645 -0.0276 0.2811 胭脂红 LOff 5 99.9308 -0.0717 0.4551 日落黄 LOff 5 99.9943 -0.0315 0.5210 诱惑红 LOff 5 99.9986 -0.0172 0.4644 亮蓝 LOff 5 99.9786 -0.0624 1.3963 赤藓红 LOff 5 99.5340 -0.2763 0.7837 本方法参照国标GBT21916-2008和GBT5009.35，这两个国标分别只同时检测了八种色素，本文的方法实现了9种色素同时检测。本实验使用Acclaim PA柱，相比GBT21916-2008使用Diomonsil C18色谱柱和GBT5009.35使用YWG-C18 10um色谱，柱出峰顺序有微小差别，分离度更好，可能是因为Acclaim C18的柱子硅球粒度、封端更均匀。 标样过wax小柱回收率较好(见表7)，而样品由于受基质影响较大，加标回收率某些组分不高。 在样品前处理过程中，会发现某些色素较多地附着在塑料，甚至是玻璃管内壁，用中性、酸性溶液不能冲洗下来。对某些样品如泡泡糖，当用中、酸水洗涤试管壁时，虽然看上去已经把管壁洗至无色了，可是当加入氨水乙醇时，能看到洗下明显的红颜色。所以每次都要用碱性的1%的氨水乙醇溶液洗涤管壁否则某些色素如赤藓红回收率会明显降低。 提取色素收集合并的上清液，如果有机相含量较高，要对其进行挥发后再加水，或者直接用水将上清液稀释，之后再上小柱，以避免由于有机相含量较高导致在过SPE小柱时某些组分过早流出柱体。 样品在上SPE小柱之前要调节pH到2左右(标准品无 需此步骤)，否则由于复杂基质的影响，色素组分在小柱上保留不好，色带较宽，某些组分如靛蓝回收率也会较低。 果丹皮基质复杂，靛蓝回收率较低。 泡泡糖及橙味水中胭脂红回收率低，原因可能是样品本身某种成分对赤藓红有作用，也可能是在用2%甲酸洗脱SPE小柱上天然色素的同时，使受基质影响与小柱结合较弱的赤藓红也被部分洗脱。国标上在处理含有赤藓红的样品时，不采用聚酰胺法，原因就在于甲醇及甲酸可对赤藓红部分洗脱，本实验中，对于不太复杂的基质，赤藓红回收率还可以。 本实验需要约1h色谱柱平衡以便保证时间重现。 前处理固相WAX小柱，在上样品前一定要经过2%甲酸溶液平衡(这一步在小柱推荐的使用步骤中是没有的)，否则回收率降低。补充：用pH=4的乙酸钠缓冲盐平衡小柱无效。 本文对样品的前处理方法与国标上不同，国标GBT5009.35上用的是“聚酰胺法”和“液-液分配法”，操作较繁琐， 而国标GBT21916-2008上使用的Sep-Pak Plus QMA的小柱，由于型号较早，现在已较少使用。本实验最后选择WAX小柱进行前处理，专一性好，能够有效地去除杂质干扰。 表7.标样过wax小柱回收率数据 色素 柠檬黄 新红 苋菜红 靛蓝 胭脂红 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 回收率(%) 93.5 91.9 95.5 112.2 92.0 93.4 94.3 97.0 93.9 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 ThermoFisherSGIENTIFIC 免费服务热线：支持手机用户)ThermoFisherSCIENTIFIC       在食品加工过程中，为求得食品色泽艳丽或保持原有色泽，增进人们食欲并提高食用价值，往往需要添加着色剂。食用着色剂是使食品着色和改善食品色泽的物质，通常有食用合成色素和食用天然色素两大类。食用合成色素主要指用人工化学合成方法所制得的有机化合物，我国允许使用并使用较多的合成色素有：日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红、亮蓝、靛蓝。由于合成色素一般较天然色素色彩鲜艳、坚牢度大、性能稳定、易于着色并可任意调色、成本低廉、使用方便，近年来，随着食品工业的发展，合成色素在食品加工和储藏中的应用越来越广泛。现在国家出台的相关规定，促使食用色素生产商更加严格规范化，用量和使用范围受到严格限制。