本方法参照国标GBT21916-2008和GBT5009.35,这两个国标分别只同时检测了八种色素,本文的方法实现了9种色素同时检测。本实验使Acclaim PA柱,相比GBT21916-2008使用Diomonsil C18色谱GBT5009.35使用YWG-C18 10μm色谱,柱出峰顺序有微小差别,分离度更好,可能是因为Acclaim C18的柱子硅球粒度、封端更均匀。
2 4 食品中9种合成色素同时检测的方法 郭丽萍李仁勇金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词:液相色谱;紫外; Acclaim PA; Waters OASIS WAX;果味水;配制酒;果丹皮;果冻;泡泡糖;橡皮糖;柠檬黄;新红;苋菜红;靛蓝;胭脂红;日落黄;诱惑红;亮蓝;赤藓红; Key words: HPLC;UV detection; Acclaim PA; Waters OASIS WAX;Fruit water; Imitation wine; Candied fruit; Jelly; Bubble gum; Chewing gum;Tartrazine; New red; Amaranth; Indigo; Carmine; Sunset yellow; Fancy red;Brilliant blue; Erythrosine; 引言 在食品加工过程中,为求得食品色泽艳丽或保持原有色泽,增进人们食欲并提高食用价值,往往需要添加着色剂。食用着色剂是使食品着色和改善食品色泽的物质,通常有食用合成色素和食用天然色素两大类。食用合成色素主要指用人工化学合成方法所制得的有机化合物,我国允许使用并使用较多的合成色素有:日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红、亮蓝、靛蓝。由于合成色素一般较天然色素色彩鲜艳、坚牢度大、性能稳定、易于着色并可任意调色、成本低廉、使用方便,近年来,随着食品工业的发展,合成色素在食品加工和储藏中的应用越来越广泛。现在国家出台的相关规定,促使食用色素生产商更加严格规范化,用量和使用范围受到严格限制。 测试条件 仪器: Ultimate 3000系统;包括:带在线脱气单元的四元梯度泵,自动进样器,带有一个六通阀的柱温箱,多通道紫外检测器。 分析柱: Acclaim PA(5um, 250 mmx4.6mm); 保护柱: Acclaim PA (5um, 10mmx4.3mm); ; 柱温:25℃; 检测波长:见表1; 进样量:10pL; 淋洗液组成、流充及梯度:见表2; 表2.淋洗液组成、流速及梯度 时间 A(CH,CN) B(20mM NHOAc 流速 (min) (%) 水溶液)(%) (mL/min) 0 10 90 1 5 25 75 1 8 70 30 1 11 70 30 1 12 10 90 1 18 10 90 1 样品前处理果味水 称取适量样品,超声除去二氧化碳,取2.0g超声后的样品,加适量甲酸调节PH至4-6,上WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL2%的甲酸水溶液活化),以2%甲酸清洗,弃去全部流出液,最后以5%氨水甲醇溶液洗脱,洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩,定容至2mL,高速离心后,取上清液进行上机测试。 配制酒 称取适量样品,超声并加热除去乙醇,称取2.0g,取2.0g超声后的样品,加适量甲酸调节PH至4-6,上WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL 2%的甲酸水溶液活化),以2%甲酸清洗,弃去全部流出液,最后以5%氨水甲醇溶液洗脱,洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩,定容至2mL,高速离心后,取上清液进行上机测试。 表1.9种色素的检测波长 色素名称 柠檬黄 新红 苋菜红 靛蓝 胭脂红 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 检测波长(nm) 428 509 521 608 509 483 509 625 529 将样品研碎或切碎,称取1g,加8mL热水(约100℃),振荡提取10min,离心,收集上清液,沉淀加无水乙醇-氨水(80mL乙醇+1mL氨水,定容至100mL)2-3mL, 加热振荡提取10min,离心,取上清液,沉淀重复用氨水乙醇提取、离心2次,合并上清液,加冰醋酸调节PH至2, 转移至WAX小柱(预先经5mL甲醇、5mL水、5mL 2%的甲酸水溶液活化),以2%甲酸清洗,弃去全部流出液,最后以5%氨水甲醇溶液洗脱,洗脱液在离心浓缩仪上进行浓缩,定容至2mL,高速离心后,取上清液进行上机测试。 图3.苹果味水在428nm的吸收谱图 标准溶液分离谱图 图1.9种色素混标在428nm的吸收谱图(浓度各位10mg/L) 图4.绿冰酒在428nm的吸收谱图 样品分离谱图 图2.橙味水在428nm的吸收谱图 图5.果丹皮在428nm的吸收谱图 图6.橡皮糖在428nm的吸收谱图 图7.泡泡糖在428nm的吸收谱图 图8.果冻在428nm的吸收谱图 样品测定结果(见表3) 表3.样品测定数据 样品 柠檬黄 新红 苋菜红 胭脂红 靛蓝 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 橙味水 测定浓度(mg/L) 10.81 --- --- 1.64 13.86 --- --- --- 原样浓度(mg/L) 10.81 --- --- 1.64 --- 13.86 --- --- -- 苹果水 测定浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.507 --- 原样浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.507 --- 绿冰酒 测定浓度(mg/L) 6.83 --- --- --- --- --- --- 0.89 --- 原样浓度(mg/L) 6.83 --- --- --- --- --- --- 0.89 --- 果丹皮 测定浓度(mg/L) --- --- --- 5.25 --- --- --- --- --- 原样浓度(mg/L) --- --- --- 5.25 --- --- --- --- --- 橡皮糖 测定浓度(mg/L) --- --- --- --- --- --- 48.9 --- --- 原样浓度(mg/L) --- --- --- --- 48.9 --- --- 泡泡糖 测定浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 --- 原样浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 --- 果冻 测定浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 原样浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 加标回收实验 取浓度各为25 mg/L的混合标准溶液0.8mL,添加到2g样品中,相当于原样加标10mg/L,经前处理后,进行测定。测定加标回收率见表4。 检测限和定量限 以3倍噪音峰高为检测限,10倍噪音峰高为定量限,为0.4mg/L的谱图为标准谱图,获得标准溶液峰高和基线噪音,检测方法最低检测限和定量限见表5。 标准工作曲线 选0.4、1、3、5、10 mg/L5个浓度混标做标准曲线,结果如表6. 表5.方法检测线和定量限 组分 检测限(mg/L) 定量限(mg/L) 柠檬黄 0.6 2 新红 0.7 2.1 苋菜红 0.9 3 胭脂红 0.8 2.7 靛蓝 0.6 2.0 日落黄 0.5 1.5 诱惑红 0.5 1.7 亮蓝 0.12 0.4 赤藓红 0.5 1.6 表4.加标回收率数据 样品 柠檬黄 新红 苋菜红 胭脂红 靛蓝 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 加标样品(mg/L) 22.02 9.68 9.68 8.91 11.81 25.6 9.57 9.56 6.72 橙味水 样品浓度(mg/L) 10.81 --- --- --- 1.64 13.86 --- --- --- 回收率(%) 112.1 96.80 96.80 89.10 101.6 117.4 95.70 95.60 67.20 加标样品(mg/L) 18.9 9.49 9.53 9.06 9.25 9.41 9.49 10.10 10.30 苹果水 样品浓度(mg/L) 8.11 --- --- --- --- --- --- 0.51 --- 样品浓度(mg/L) 107.9 94.90 95.30 90.60 92.50 94.14 94.93 95.90 103.0 加标样品(mg/L) 18.11 9.83 9.72 9.22 9.52 9.54 9.61 9.36 9.97 绿冰酒 样品浓度(mg/L) 6.83 --- --一 --- --- --- --- 0.89 --- 回收率(%) 112.8 98.30 97.20 92.20 95.20 95.40 96.10 84.70 99.70 加标样品(mg/L) 8.736 9.133 8.96 6.417 22.18 9.026 9.008 8.683 8.065 果丹皮 样品浓度(mg/L) --- --- --- --- 10.47 --- --- 回收率(%) 87.36 91.33 89.60 64.17 117.1 90.26 90.08 86.83 80.65 加标样品(mg/L) 27.78 9.196 9.27 8.317 8.832 40.19 14.31 9.285 7.752 橡皮糖 样品浓度(mg/L) 18.06 --- ---一 --- 0.2635 28.53 4.579 --- --- 回收率(%) 97.20 91.96 92.70 83.17 85.68 116.7 97.31 92.85 77.52 加标样品(mg/L) 12.67 7.724 8.284 8.125 7.913 8.260 10.74 11.42 6.031 泡泡糖 样品浓度(mg/L) 3.42 --- --- --- --- --- 0.92 0.363 0 回收率(%) 92.50 77.24 82.84 81.25 79.13 82.60 98.20 110.5 60.31 加标样品(mg/L) 11.56 10.50 10.49 11.96 10.24 10.91 10.44 10.59 8.670 果冻 样品浓度(mg/L) 0.72 --- --- --- --- --- --- --- --- 回收率(%) 108.4 105.0 104.9 119.6 102.4 109.1 104.4 105.9 86.70 表6.标准曲线数据 Peak Name Cal. Type Points Coeff. Det. Offset Slope 柠檬黄 LOff 5 99.9966 -0.0327 0.5015 新红 LOff 5 99.8282 -0.0007 0.4128 苋菜红 LOff 5 99.9785 -0.0516 0.2962 靛蓝 LOff 5 99.8645 -0.0276 0.2811 胭脂红 LOff 5 99.9308 -0.0717 0.4551 日落黄 LOff 5 99.9943 -0.0315 0.5210 诱惑红 LOff 5 99.9986 -0.0172 0.4644 亮蓝 LOff 5 99.9786 -0.0624 1.3963 赤藓红 LOff 5 99.5340 -0.2763 0.7837 本方法参照国标GBT21916-2008和GBT5009.35,这两个国标分别只同时检测了八种色素,本文的方法实现了9种色素同时检测。本实验使用Acclaim PA柱,相比GBT21916-2008使用Diomonsil C18色谱柱和GBT5009.35使用YWG-C18 10um色谱,柱出峰顺序有微小差别,分离度更好,可能是因为Acclaim C18的柱子硅球粒度、封端更均匀。 标样过wax小柱回收率较好(见表7),而样品由于受基质影响较大,加标回收率某些组分不高。 在样品前处理过程中,会发现某些色素较多地附着在塑料,甚至是玻璃管内壁,用中性、酸性溶液不能冲洗下来。对某些样品如泡泡糖,当用中、酸水洗涤试管壁时,虽然看上去已经把管壁洗至无色了,可是当加入氨水乙醇时,能看到洗下明显的红颜色。所以每次都要用碱性的1%的氨水乙醇溶液洗涤管壁否则某些色素如赤藓红回收率会明显降低。 提取色素收集合并的上清液,如果有机相含量较高,要对其进行挥发后再加水,或者直接用水将上清液稀释,之后再上小柱,以避免由于有机相含量较高导致在过SPE小柱时某些组分过早流出柱体。 样品在上SPE小柱之前要调节pH到2左右(标准品无 需此步骤),否则由于复杂基质的影响,色素组分在小柱上保留不好,色带较宽,某些组分如靛蓝回收率也会较低。 果丹皮基质复杂,靛蓝回收率较低。 泡泡糖及橙味水中胭脂红回收率低,原因可能是样品本身某种成分对赤藓红有作用,也可能是在用2%甲酸洗脱SPE小柱上天然色素的同时,使受基质影响与小柱结合较弱的赤藓红也被部分洗脱。国标上在处理含有赤藓红的样品时,不采用聚酰胺法,原因就在于甲醇及甲酸可对赤藓红部分洗脱,本实验中,对于不太复杂的基质,赤藓红回收率还可以。 本实验需要约1h色谱柱平衡以便保证时间重现。 前处理固相WAX小柱,在上样品前一定要经过2%甲酸溶液平衡(这一步在小柱推荐的使用步骤中是没有的),否则回收率降低。补充:用pH=4的乙酸钠缓冲盐平衡小柱无效。 本文对样品的前处理方法与国标上不同,国标GBT5009.35上用的是“聚酰胺法”和“液-液分配法”,操作较繁琐, 而国标GBT21916-2008上使用的Sep-Pak Plus QMA的小柱,由于型号较早,现在已较少使用。本实验最后选择WAX小柱进行前处理,专一性好,能够有效地去除杂质干扰。 表7.标样过wax小柱回收率数据 色素 柠檬黄 新红 苋菜红 靛蓝 胭脂红 日落黄 诱惑红 亮蓝 赤藓红 回收率(%) 93.5 91.9 95.5 112.2 92.0 93.4 94.3 97.0 93.9 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 ThermoFisherSGIENTIFIC 免费服务热线:支持手机用户)ThermoFisherSCIENTIFIC 在食品加工过程中,为求得食品色泽艳丽或保持原有色泽,增进人们食欲并提高食用价值,往往需要添加着色剂。食用着色剂是使食品着色和改善食品色泽的物质,通常有食用合成色素和食用天然色素两大类。食用合成色素主要指用人工化学合成方法所制得的有机化合物,我国允许使用并使用较多的合成色素有:日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红、亮蓝、靛蓝。由于合成色素一般较天然色素色彩鲜艳、坚牢度大、性能稳定、易于着色并可任意调色、成本低廉、使用方便,近年来,随着食品工业的发展,合成色素在食品加工和储藏中的应用越来越广泛。现在国家出台的相关规定,促使食用色素生产商更加严格规范化,用量和使用范围受到严格限制。
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