普洱茶中黄曲霉毒素和呕吐毒素检测方案(旋涡混合器)

ANPEL上海安谱实验科技股份有限公司ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai) Inc.20年专注实验室色谱耗材业务200位专业人员全程服务 4000万货值库存保证版本号： YZH-20170914 安谱总部 地址：上海市徐汇区斜土路2899甲号B 幢606室 网址： www.anpel.com.cn Tel：021-54890099 Fax： 54248311北京办事处 广州办事处 深圳办事处 武汉办事处 成都办事处 南京办事处Tel ：010-83130651 Tel：020-38811673 Tel：0755-26075073 Tel：027-88017997 Tel ：028-85254001/2/3 Tel ： 025-83737312 83716726Fax： 010-83130098 Fax： 020-38811631 Fax： 0755-26075056 Fax： 021-54248311 Fax： 028-85254001*209 Fax： 025-83701408 9000家客户口碑鉴证 普洱茶中黄曲霉毒素和呕吐毒素的检测 近日，著名打假人士方舟子，质疑普洱茶中含有黄曲霉毒素，呕吐毒素等致癌物质，引起茶界一片哗然，各界人士及网友们众说纷纭，同时方舟子也列举出广州疾控和南昌大学硕士论文对普洱茶相关毒素的检测结果，所采集样品均呈阳性。面对如此情况，安谱实验立即安排实验，采用液相色谱法对普洱茶中的黄曲霉毒素，呕吐毒素进行了检测，用详实的数据、谱图来探究普洱茶中所含毒素的真实情况。 一、普洱茶中黄曲霉毒素的检测 (参考GB 5009.22-2016食品中黄曲霉毒素的检测第三法高效液相色谱-柱后衍生法) 样品前处理 准确称取2g粉碎的茶叶试样，置于 50 mL 离心管中，加入10 mL(乙腈+水)溶液(84+16)，涡旋3min， 超声 15min， 4000rpm离心8min。取4mL上清液， 加12mL PBS 缓冲溶液稀释，混匀，待净化 加标溶液：CDGG-116870-03 (o2si 品牌)黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2混标1：0.3：1：0.3ppm 25uL 小柱操作 黄曲霉毒素免疫亲和柱 (SBHL-20-0383，Beacon品牌)恢复室温后让柱内缓冲液流完。上样：控制流速1d/s淋洗： 5mL PBS 淋洗 ， 5mL水淋洗，淋洗完后抽干，洗脱：用2mL甲醇洗脱，控制流速1d/s 50℃氮吹到近干，用流动相定容到1mL，过滤，待进样 色谱条件 a)流动相：A：水，B：甲醇/乙腈(16+16) b)色谱柱：CNW Athena C18-WP 液相色谱柱(4.6*150mm，5um) c) 流速：1.0mL/min d) 柱温：40℃ e) 进样体积：20pL f) 检测波长：激发波长360nm；发射波长 440nm 柱后衍生系统 岂斯科光化学衍生器(SBHL-YQ-1，凯斯科品牌)，接在色谱柱和检测器之间 二、普洱茶中呕吐毒素的检测 (参考GB 5009.111-2016食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定第二法免疫亲和层析净化高效液液色谱法) 样品前处理 取2g茶叶，加入20mL去离子水，涡旋 1min ， 超声20min， 4000rpm 离心 8min， 取上清液 2mL过柱。 ( 加标溶液：CDGG-014445-06 (o2si 品牌)脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)标准品 200 ug/mL 于甲醇加标 50uL ) 小柱操作 呕吐毒素免疫亲和柱(SBHL-20-0347，Beacon品牌)恢复室温后，让柱内缓冲液流完 上样：2mL上样液加到小柱上面，控制流速 1d/s 淋洗： 5mLPBS溶液洗涤，5mL水洗涤 洗脱：2ml甲醇洗脱，控制流速1d/s 甲醇氮吹近干后，加流动相定容到1mL。涡旋，过滤，待上机检测 色谱条件 a)流动相：甲醇：水(2：8) b) 色谱柱： CNW Athena C18-WP 夜相色谱柱(4.6*150mm，5um)c) 流速：1.0mL/min d) 柱温：35℃ e)进样体本：20pL f)检测波长：218nm 三、实验谱图 1200000 图1：黄曲霉毒素 10ppb标准品谱图(黄曲霉检测) 图6：呕吐毒素1ppm标准品谱图(呕吐毒素检测) 图2：生茶基质谱图(黄曲霉检测) 图7：生茶基质谱图(呕吐毒素检测) 图3：熟茶基质谱图(黄曲霉检测) 图8：熟茶基质谱图(吐毒素检测) 图4：生茶基质加标10ppb谱图(黄曲霉检测) 图5：熟茶基质加标10ppb谱图(黄曲霉检测) 图9：熟茶基质加标1ppm谱图(呕吐毒素检测) 网址： www.anpel.com.cn Tel： 021-54890099 Fax：54248311 武汉办事处 成都办事处 南京办事处 Tel：027-88017997 Tel：028-85254001/2/3 Tel ： 025-83737312 83716726 Fax： 021-54248311 Fax： 028-85254001*209 Fax： 025-83701408 安谱总部 地址：上海市徐余区斜土路2899甲号B幢606室 北京办事处 广州办事处 深圳办事处 Tel ： 010-83130651 Tel ：020-38811673 Tel ：0755-26075073 Fax： 010-83130098 Fax：020-38811631 Fax： 0755-26075056 化学试剂 标准品 四、实验数据 黄曲霉毒素 目标物 生茶基质 熟茶基质 生茶加标10ppb 熟茶加标10ppb 生茶加标回收率% 熟茶加标回收率% 黄曲霉 G2 (ng/mL) nd nd 3.9 5.9 39% 59% 黄曲霉 G1 (ng/mL) nd nd 7 6.9 70% 69% 黄曲霉 B2 (ng/mL) nd nd 8 8.3 80% 83% 黄曲霉 B1 (ng/mL) nd nd 8.7 8.1 87% 81% 呕吐毒素 目标物 生茶基质 熟茶基质 熟茶加标1ppm 熟茶加标回收率% 呕吐毒素 nd nd 0.92ppm 91.2 五、分析讨论 1、从数据上我们可以看出，市面上购买的普洱茶生茶和熟茶均没有检测到黄曲霉毒素和呕吐毒素。但是限于我们样品来源有限，从我们检测的样品来看，正常渠道购买的普洱茶一般都没有问题，大家可以放心饮用。 2、黄曲霉毒素B2、B1的加标回收率可以达到80%以上，但是G2、G1平均只有40-70%，不是很稳定，后来经过排查，发现G2、G1极易降解，隔一段时间进样，峰面积就会降低很多，相对来说，B2， B1的回收率比较稳定，另外食品中最容易污染，关注度最高的也是黄曲霉毒素B1， 并且是毒性最强，致癌性最强的毒素。呕吐毒素的回收率非常稳定，达到90%以上。 3、总体来说，免疫亲和层析高效液相色谱-柱后光化学衍生法检测普洱茶中黄曲霉毒素，免疫亲和层析净化高效液相色谱法检测呕吐毒素是非常可靠的方法，目前国家对黄曲霉B1的限值，玉米制品为20ppb， 稻舀及其制品10ppb，小麦及其制品5ppb， 呕吐毒素在玉米小麦中的限值为 1ppm，根据国标方法，黄曲霉毒素的定量限达 0.5ppb，呕吐毒素的定量限可以达到 0.2ppm，均低于国家的限值。 六、黄曲霉毒素和呕吐毒素检测实验耗材包 货号 名称 规格 品牌 SBHL-20-0383 美国 Beacon 黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 (B1，B2， G1 ， G2) 3mL， 20支/盒 Beacon SBHL-20-0347 美国 Beacon 呕吐毒素免疫亲和柱 3mL，20支/盒 Beacon CDGG-116870-17-1ml 黄曲霉毒素B1、B2G1、G2混标 ( GB/T 5009.22-2016)标准品 1 mg/L于乙腈， 1 ml于Certan Vial o2si CDGG-116870-03 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混标(GB/T 5009.22-2016)方法2方法3标准品 不同浓度于乙腈， 1 ml 于 Certan Vial o2si CDGG-014445-06 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)标准品 200 ug/mL于甲醇 ， 1mL o2si LAEQ-461572 Athena C18-WP液相色谱柱 4.6*150mm， 5um CNW SBHL-YQ-01 凯斯科光化学衍生器 PCS 凯斯科 SBEQ-CR0002 SPE 小柱连接件【1，3，6mL】， PP 材质 12个/包 CNW SBEQ-CR1012 CNW 12 位固相萃取真空装置 12位 CNW SCAA-114 亲水PTFE针式滤器 13mm*0.22um，100只/罐 ANPEL SCAA-113 亲水PTFE 针式滤器 13mm*0.45um， 100只/罐 ANPEL QBAA-002012 2ml 无针注射器 100只/包 ANPEL ABEQ-3300002-25 CNW 50ml 尖底离心管 25/袋 CNW ADEQ-2600111 3ml塑料巴斯德吸管、160mm、未灭菌 500/箱 CNW VAAP-32009E-1232A-100 CNW 9mm 透明螺纹口自动进样瓶(带刻度、书写) 2ml， 12*32mm， 9mm，100只/盒 CNW VEAP-5394-09FRB-100 兼容 Agilent 的 9mm 蓝色开孔拧盖、 含PTFE/橡胶隔垫， Bond 100/袋 CNW CAEQ-4-003306-4000 HPLC级别通用型乙腈(也适用于生化，无水分析领域) 4L CNW CAEQ-4-003302-4000 HPLC级甲醇，梯度级 4L CNW EOFO-945605 Talboys 基本型旋涡混合器，230V/150W 外形尺寸：20.3×10.2×14.0cm，包装重量：5.3kg Talboys EDAA-2101TH 超声波清洗器，100W(带加热功能) 槽内尺寸：300*150*100mm， 4L ANPEL Fax： 54248311 近日，著名打假人士方舟子，质疑普洱茶中含有黄曲霉毒素，呕吐毒素等致癌物质，引起茶界一片哗然，各界人士及网友们众说纷纭，同时方舟子也列举出广州疾控和南昌大学硕士论文对普洱茶相关毒素的检测结果，所采集样品均呈阳性。面对如此情况，安谱实验立即安排实验，采用液相色谱法对普洱茶中的黄曲霉毒素，呕吐毒素进行了检测，用详实的数据、谱图来探究普洱茶中所含毒素的真实情况。