蛋白中配体垂钓检测方案(大分子作用仪)

应用 Biacore 3000系统进行配体垂钓 摘要 近年来，多个研究小组都相继发表了 Biacore 的 SPR 技术在蛋白质组研究领域中的应用，尤其是对重要蛋白的配体垂钓并结合质谱技术对与重要蛋白相结合的配体识别的应用特别引人注目。有两种主要的实验方法：用质谱对结合在芯片表面的蛋白直接检测；微量回收结合的蛋白后再检测。在此，我们将报告一个从复杂生物混合物中进行配体垂钓再结合质谱技术对能特异性结合的配体进行识别的实验。与很多已发表的文献中的方法不同的是，这个方法没有对现有的 Biacore 3000 进行任何硬件和软件的修改。 导言 钙调蛋白(CaM)是真核细胞中普遍存在的钙离子结合蛋白，是细胞反应的主要生理效应器之一。钙-钙调蛋白参与了胞内钙平衡的维持，同时调节了胞内第二信使的浓度如 AMP 和肌醇磷酸盐的循环。这些信使参与了核蛋白转入的活化，从而建立了信号传导和核运输的关联。 上图 (Fig1)显示了一个载有钙离子的钙调蛋白与肌球蛋白轻链激酶的肽片段结合，这是与钙调蛋白有生理作用的其中一个酶。被显示的部分是13个氨基酸长的肽片段，其结果摘自 Meador et al.， PDBID code 1CDL. 在我们的实验体系中26-巯基的 M13 肽被耦连到 CM5芯片表面，用来选择性的从标准的 CaM溶液和牛脑粗提液中捕获CaM。 Figure1载有钙离子的钙调蛋白与肌球蛋白轻链激酶的肽片 段结合 材料 实验在 Biacore 3000 上进行，实验温度25℃。以补充了 2mM CaCl的 HBS-N缓冲液作为流动缓冲液。M13肽片段是用户用 MedProbe (Oslo，Norway) 自行合成的，并用氨基耦连的方法耦连到CM5芯片的4个通道上。牛脑钙调蛋白标准品购自 Calbiochem (La Jolla， CA)，牛脑粗提液来自 Sigma (Stockholm，Sweden)。 Figure2. 钙调蛋白标准品的结合和回收传感图 Figure3 从牛脑粗替液中回收钙调蛋白的传感图 微量回收钙调蛋白标准品 将60u1， 50n g/ml的钙调蛋白加到耦连了M13肽片段的芯片表面，进样速度10 ul/min。 待结合过程达到平衡时，停止进样并用70%的蚁酸清洗针头一次，再用流动缓冲液清洗针头两次。接着进行 BYPASSWASH步骤：以50mM的NaOH为洗液1，，10mM HEPES 为洗液 2及10u mCaCl为洗液3。回收后的清洗也用洗液3。从传感图 (Fig2)上看出每个通道内约 2.5ng(1000RU 约合 lng 蛋白)的钙调蛋白被结合了，相当于有600fmol 的总量能被回收。最后用 0.5%的 TFA溶液回收结合在芯片表面的钙调蛋白，回收时TFA溶液与芯片表面的接触时间为25秒。4u1的回收洗出液过ZipTipw-C18 (Millipore) 反相柱上MALDI 质谱。 从牛脑粗提液中微量回收钙调蛋白将 10 mg/ml 的牛脑粗提液与流动缓冲液充分混匀。离心去除不溶解的残渣。上清液用流动缓冲液稀释10倍后取 的芯片表面，进样速度20 u1/min。回收方法与回收钙调蛋白标准品的方法相同，只是用流动缓冲液代替了 BYPASSWASH的洗液2和洗液3.。可回收的钙调蛋白总量为4600RU 约合 275fmol(Fig3)。 上 MALDI MS 前的样品纯化 从芯片表面回收到的有限的样品需经过浓缩以获得最高的检测灵敏度。ZipTip (Millipore)由于在枪头上填入了反相树脂(床体积1u1)，是一个能达到这个目的的有效工具。通过 ZipTip 被浓缩和脱盐的样品可以被仅仅0.5u1的洗出液洗脱。因此，我们的实验也用 ZipTip 处理被回收的钙调蛋白标准品。 为了进一步减少洗出液的体积并 提高检测灵敏度，面可用 GELoader tip (Eppendorf) 在末端填入 POROS 50 R2反相树脂 (Perseptive Biosystems，床体积 20nl) 自制一个毫微柱。这种毫微 柱可以使样品洗出液的体积比 ZipTip减少10倍(Fig4)。这个 纯化方法被用来处理从牛脑粗提 液中垂钓获得的钙调蛋白。 湿润 6×10u150%ACN/0.1% TFA 平衡 6X10u10.1%TFA 上样 15×及/放3.5p1的芯片表面回收液 冲洗 5X10u1 0.1%TFA 洗脱 0.5u1加入了 20mg/ml sinapinic acid (SA) 的70%ACN， 1%TFA，上MALDI时靶蛋白 被一薄层SA 晶体覆盖(20mg/ml SA 溶于丙酮) 用 GELoader tip 浓缩样品并去盐的步骤 湿润 20 u1 60%ACN/0.1%TFA 平衡 20 u1 0.1%TFA 上样 缓慢地让3.5u1的芯片表面回收液流过 冲洗 20 u1 0.1% TFA 洗脱 50nl 加入了 20mg/ml sinapinic acid (SA)的 60%ACN， 1%TFA， 上MALDI时靶蛋白被 一薄层 SA 晶体覆盖(20mg/ml SA 溶于丙 酮) Figure 4.充满了 POROS 50 R2 的 GELoader tip 和 ZipTip反相柱GELoader tip 的柱长约0.6mm Figure 5 微量回收的钙调蛋白标准品 MALDI谱图 回收标准品的洗出液用 ZipTip pu-C18柱浓缩和脱盐 Figure 6 牛脑粗提液的 MALDI 谱图 1mg/ml 牛脑粗提液 1ml 与9ml 0.5% TFA混合，用GELoader 柱缩缩和脱盐 Figure 7 洗出液用 GELoader柱浓缩和脱盐 BIACORE www.biacore.com MALDI-TOF 质谱普图 所有的谱图都是通过 Bruker ReflexIII MALDI-TOF 得到的。分离使用线性模式，延迟激发和分子量小于 12kDa 的小分子 cut off. (效抑制8kDa 以下的信号)。应用了20kv 和 17.7kv 的两步加速。 结果 未经 Biacore 微量回收的牛脑粗提 液产生了一个有多个峰的谱图 (Fig6)。而流经芯片表面再回 收，然后做浓缩和去盐处理的牛脑 粗提液产生了一个与钙调蛋白标准品一致的单峰谱图(Fig5，77)。 结论 成功的建立了一个将 Biacore 和MS相结合进行蛋白质组研究的典型方法。这个方法不仅能进行蛋白的识别，而且能揭示蛋白的功能。这个方法完全基于现有的Biacore 硬件和软件。 ( References ) ( 1 . C arsten P . Sonksen， Osten Jasson， Magnus Malmqvist and P e ter Roepstroff，Poster Presentation. An Improved Method for Combining Biacore Ins t rument withMALDI Mass Spectrometry ) ( 2. C arsten P . Sonksen， Eckhard Nordhoof， Osten Hansson， Magnus M almqvistand P eter Roepstorff； Anal. Chem. (1998) 70， 2721-2736 Combining MAL D I M as s Spectrometry and Biomolecular Interaction Analysis Using a Biomolecular I nteraction Analysis Instrument ) ( 3. R. W. N e lson， D . N e delkov and K. A. Tu bb s； Electrophoresis 21： 1 1 55-63(2000) Biosensor c hip mass s pectrometry： a chip-based proteomics approach ) 4. C. Williams and T. A. Addona； Trends Biotechnol 18： 45-8 (2000) The ( i ntegration of SPR biosensors with m a ss sp e ctrometry： possible applications for proteome analysis ) ( 5. R . W. Nelson， D. Nedelkov and K. A. Tubbs； Anal Chem 72： 404A-411A (2000) Biomolecular Interaction Analysis Mass Spectrometry. BIA/MS can detectand characterize proteins in complex biological f l uids at the low to subfemtomolelevel )