自身免疫性神经病中抗体水平检测方案(大分子作用仪)

图2血清中的抗 GM1 抗体被检测到并被记录成传感图的形式。(A)进样后GM1表面和 GM2 表面的传感图结果。(B)GM1 表面传感图结果减去对照表面 GM2后所得的抗GM1抗体结合的净值。最终的测量结果取进样结束后20秒的信号值。S表示进样开始点，E表示进样结束点。 Armin Alaedini and Norman Latov1 Department of Neurosciences， Cornell University and Department of Neurology， ColumbiaUniversity， New York， NY， USA Biacore 公司的 SPR是一种适合检测抗原和抗体相互作用的技术，，因此被用来测量病人的抗体水平。 我们用这种方法来测量多交点运动神经病患者(mutilfocal motorneuropathy)或格-巴二氏综合症患者体内存在的抗 GM1 神经节苷脂的抗体，这两种神经疾病都被怀疑存在自身免疫的病因(1)。与 ELISA 相比较，这种方法更准确和精确，检测更灵敏，操作简单而且速度较快。 检测和定量标志抗体对多种免疫疾病的诊断是很重要的。在一些自身免疫性神经病中，抗神经节苷脂的抗体效价升高与疾病直接相关，因而测量这些抗体的水平被用来跟踪疾病的康复和发展。现在用来检测这些自身抗体的方法主要是 ELISA， 这是一种费时而且比较费人力的方法，而且也存在方法易变的方法学上的争论(2，3)。因此，需要一种更快速更可靠的方法来测量抗神经节苷脂的抗体。应用SPR 技术，抗体的存在以及随后的与已固定的神经节苷脂的反应能被实时监测(图1)。神经节苷脂被固定在羧基化程度较低的 B1 芯片上。在固定一层神经节苷脂到芯片时，芯片先在4℃的HBS-N 缓冲液中孵育48小时，再固定神经节苷脂。作为 GM1的对照，在芯片的另一个通道上用相同的方法固定结构类似的 GM2神经节苷脂。在每个通道上都固定上上200RU 的神经节苷脂。血清样品用含有1mg/ml羧基化葡聚糖的上述缓冲液1：10稀释再进样一分钟并都留过两个通道。减去GM2 对照通道上的信号后得到阳性的结合传感图说明了病人的血清中存在 GM1 抗体，抗体水平的净值取进样结束后20秒的结合信号值(图2)。通过进样三次浓度为5到20mM的NaOH来再生表面，根据抗体结合的量来选择 NaOH浓度。Biacore 系统在检测灵敏度和特异性方面与ELISA完全有可比性。但是在检测极限方面还有待改进，上，可在进样后再加一个二抗来放大信号(图3)。此外， Biacore 系统能够分辨出用 ELISA 测抗体效价相同的血清的差异，因为与 ELISA 的方法相反， Biacore 所提供的信息 形式是游离抗体的效价，因而能代表血清中精确的抗体浓度。要分 辨出用ELISA 测抗体效价相同的血清的差异并得到与 Biacore 方法 准确性相当的结果，则要将样品稀释成一系列的浓度。在测试该方 图3 用二抗放大信号。A：进样稀释后的有抗GM1抗体的MMN患者的血清的过程。B：在血清进样完成后进样0.5mg/m的抗人的IgM 把信号放大了约六倍。 图1图示 Biacore 的SPR技术原理。GM1被固定在芯片上，抗-GM1 与Ggm1的结合会改变芯片表面的溶液夜光率从而改变被监测的 SPR角。 法的线性范围时，分析了一个有代表性的 MMN 病人的血清，在1：50的稀释范围内的线性情况，当浓度较高时，曲线呈指数关系(图4)。 我们在血清进样结束后加入了抗人的 IgG 或 IgM 抗体是为了证实存在同型的抗神经节苷脂免疫球蛋白。抗人的 IgM 能继续结合说明MMN 患者的血清型为IgM， 而抗人的 IgG 能继续结合说明格-巴二氏综合症患者的血清型为IgG (图5). 图4一组 MMN 病人血清稀释的传感图，稀释范围为(1：5到1-nn 极大的减少了样品准备的时间和提高了完成检测的速度，使 Biacore 成为令人向往的对自身免疫抗体检测的快速筛查工具。这个方法对病情的诊断以及在治疗中及时跟踪病人血清中的抗体水平都很有帮助。此外，这个方法可通过改变芯片上的 GM1 来检测抗体与其它不同的神经节苷脂的结合，或者固定其他的抗原来诊断多种自身免疫疾病也是可行的。 References： 1. Alaedini A， Latov N. A surface plasmon resonancebiosensor assay formeasurement of anti-GM1antibodies in neuropthy. 2. Neurology 56：855-60 (2001)Marcus DM， Latov N. Measurement andsignificance of anit-bodiesagainst GM1 ganglioside.JNeuroimmunol 25：255-9(1989) 3. Holloway RG， Feasby TE.To test or not to test? That isthe question. Neurology53：1905-7 (1999) 图5用二抗来识别抗 GM1的抗体型。(A)在进进MMN 病人的血清样品后加抗人的 IgG 和IgM，抗人的IgM 能结合说明血清中的抗体为IgM。(B) 在进样格-巴二氏综合症患者的血清样品后加抗人的IgG和IgM， 抗人的IgG 能结合说明血清中的抗体为IgG。