免疫抑制剂中特异性检测方案(液质联用仪)

waters.com 应用纪要THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 沃特世应用文集临床检测 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 几乎检测不到的差异可以带来无法估量的改变。 全世界的临床实验室都十分注重报告的质量和真实性。准确的测试结果对于临床研究以及常规诊断测试来说非常重要。沃特世的专注造就了首个经FDA认可的体外诊断LC-MS/MS检测方法。无论您是在寻找一种新型生物标记物、鉴定最新的合成毒品还是想要让常规实验室检测达到更高的性能水平，沃特世都能帮助您取得成功。有关沃特世如何为您的临床实验室提供全面解决方案，请访问waters.com/clinical THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 制药|健康科学|食品与环境|化工 目录 新生儿遗传代谢疾病筛查 4 使用LC-MS/MS分析血清中25-羟基维生素D 7 使用LC-MS/MS检测血浆中儿茶酚胺代谢物变肾上腺素类激素 10 使用LC-MS/MS检测血浆中醛固酮 13 使用LC-MS/MS进行新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查 16 使用LC-MS/MS检测血清中睾酮和雄烯二酮 19 使用LC-MS/MS检测血浆中雌二醇 22 使用LC-MS/MS同时检测四种免疫抑制剂 24 使用LC-MS/MS分析血清中多种精神治疗药物 28 使用LC-MS/MS分析血样中多种抗癫痫药物 31 使用LC-MS/MS分析血样中甲氨蝶呤 34 使用LC-MS/MS分析血清中抗真菌唑类药物 37 使用LC-MS/MS分析血浆中同型半胱氨酸 40 使用LC-MS/MS分析生物样品中全谱氨基酸 43 使用LC-MS/MS进行法医毒理学筛查 46 使用LC-Tof-MS筛查尿液中常规与新型毒品 49 参考文献 52 Waters 新生儿遗传代谢疾病筛查 背景 遗传代谢病(Inherited Metabolic Disorders，IMD)， 是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体及载体的生物合成存在遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的一系列疾病。又称遗传代谢异常或先天代谢缺陷。大多为单基因病，属常染色体隐性遗传。主要包括氨基酸代谢病，有机酸代谢病和脂肪酸代谢病。常表现为神经系统异常、代谢性酸中毒和酮症、严重呕吐、肝脏肿大或肝功能不全、特殊气味、容貌怪异、皮肤和毛发异常、眼部异常、耳聋等，可能会造成患者痴痴、脑瘫、甚至昏迷、死亡等严重并发症。例如苯丙酮尿症，患者体内缺乏苯丙氨酸羟化酶，导致苯丙氨酸的转化为酪氨酸受阻，造成血液和组织中苯丙氨酸的大量积累，会造成中枢神经系统受伤害，导致智力低下，引起先天性痴呆。及早诊断、及早治疗绝大部分遗传代谢疾病都可以治疗或者减轻症状。开展新生儿遗传代谢疾病筛查对于提高患者、家庭生活质量非常重要。 传统技术在进行遗传代谢疾病筛查时，一次实验只能检测一种指标，只能针对一种疾病进行筛查，扩展检测项目非常复杂与昂贵。与传统技术相比，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)一滴血片，一次实验可以检测40多种指标，可以对多达40多种遗传性代谢疾病进行筛查，简单，经济，可扩展性强，适合临床大规模开展。国际新生儿疾病筛查发展趋势逐步提高到以串联质谱(MS/MS)技术为中心的筛查，如欧美等国目前已经广泛采用LC-MS/MS法对新生儿遗传疾病筛查。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： XevoTQD 样品制备方法 1.使用自动或者手动打孔器，打孔干血片滤纸到平底96孔微孔板中。干血片的直径近似3.2 mm。 2.使用多通道移液器移取工作提取液加入到有干血片的96孔板中，用粘性膜覆盖96孔板，保证溶液蒸发最少。 3.覆盖后，96孔板使用孵育震荡器在+45℃(±5℃)震荡45(±10)min， 震摇速度650-750rpm。 4.使用移液器向每孔加入复溶液， 覆盖铝箔。 5.将96孔板放在自动进样器中，准备分析。 结果 色谱图 一次分析数十种氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱，可以对40多种遗传性代谢疾病进行筛查，每次分析时间<2 min。 数据处理 沃特世有专门为遗传代谢疾病筛查软件。配套的NeoLynx软件系统，不需要手动处理大量的质谱数据，每个样品相应色谱图、质谱图、检测指标测量值、参考值范围等都会显示，快速，简单，直观。可以根据需要直接导出检测报告。 Test Name Low Conc Calculated Conc High Conc ALA 496 552 860 CIT 71.00 79.75 119 GLY 892 1014 1348 LEU 299 389 471 MET 90.00 106 134 MET IS int 0.00 7960 1.00e+7 0.00 5949 1.00e+7 PHE 164 226 254 PHE IS int 0.00 2.52e+4 1.00e+7 PHE int 0.00 4.13e+4 1.00e+7 PRO 475 495 755 TYR 242 253 394 VAL 294 353 510 C0 67.00 102 119 C2 44.80 62.66 74.40 Function C3 6.70 9.78 12.30 C3 IS int 0.00 3.68e+4 1.00e+7 C3 int 0.00 1.21e+5 1.00e+7 C4 1.58 2.31 2.90 C5 0.83 1.13 1.43 C5DC_C6OH 0.46 0.68 0.86 C6 0.34 0.46 0.62 C8 0.44 0.57 0.84 C8 IS int 0.00 5.38e+4 1.00e+7 C8 int 0.00 1.21e+4 1.00e+7 C10 0.68 0.86 1.20 Compound Result C12 1.28 1.54 2.16 All Tests Within Limits C14 1.05 1.52 1.93 C16 6.60 1.47 10.20 1.98 13.00 2.87 总结 沃特世有专为新生儿遗传代谢疾病筛查而开发的成熟检测方法，包括仪器、软件、方法。整个检测过程快速、准确、可靠。操作人员按步骤实施即可，简单、直观、易行。配套的NeoLynx软件系统不需要手动处理大量的质谱分析数据，可以直接根据需要导出检测报告。 沃特斯中国有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， ACQUITY UPLC， ACQUITY， Xevo和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。NeoLynx是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-5209 3866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 免费售后服务热线：800(400)820 2676 Waters 使用LC-MS/MS分析血清中25-羟基维生素D 背景 维生素D缺乏症在世界许多地区的成人和儿童中非常普遍。除了众所周知的影响(例如与钙吸收障碍相关的佝偻病、骨质疏松症和骨软化症)外，现在越来越多的证据表明维生素D缺乏症还会增加罹患某些癌症的风险，并对许多其它疾病有一定的影响，例如：糖尿病，心血管疾病，多发性硬化，精神类疾病等。维生素D具有两种存在形式，一种是皮肤暴露于日光下所产生的维生素D3，另一种则是存在于多种补品中的植物衍生物维生素D2。维生素D在肝脏中代谢形成25-羟基维生素D(250HD)，后者在肾脏中进一步代谢形成活性代谢物1，25-二羟基维生素D。250HD的水平被认为是评价体内维生素D水平的最佳临床指标。维生素D水平的评估对于维生素D缺乏症的诊断和补充治疗的监测非常重要。传统免疫检测的主要问题是无法区分250HD2和250HD3，还需依靠抗体与250HD2的交叉反应才能测定250HD的总浓度。如果该交叉反应低于100%，那么D2治疗可能无法得到准确监测。因此，利用LC-MS/MS方法定量分析250HD2和250HD3在提高检测质量和降低成本方面，更加受到人们的青睐，已经成为250HD检测的金标准。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： ACQUITY@ TQD/Xevo@TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC BEHC ， 2.1 x 50 mm， 1.7 um (PN：186002877) 样品制备方法 血清置于2mL微量离心管中，加入内标溶液，涡旋混合。加入ZnSO 溶液并涡旋混合。加入甲醇混合，以沉淀血清中存在的蛋白质。加入己烷，用以提取250HD，混合。然后将样品在13000rpm下离心5 min。移取己烷层并将其置于沃特世最大回收样品瓶中，在50℃的氮气下蒸发至干。最后将样品复溶。 结果线性 使用QuanLynxM定量软件和ApexTrack积分算法进行数据处理。以2.5-100 ng/mL作为浓度范围对分析方法的线性进行考察。250HD3的确定系数(R2)>0.999， 250HD2的确定系数(R2)>0.997。 精度 通过提取低、中和高浓度的QC样品并重复分析5次以测定批内精度。根据这三个浓度水平计算250HD的变异系数(CV)。对低、中和高浓度的QC样品进行连续5天的分析，测定批间精度。 低浓度 QC 中浓度 QC 高浓度 QC 25(0H)D2 25(0H)D3 25(0H)D2 25(0H)D3 25(0H)D2 25(0H)D3 批内精度 CV% 5.6 7.5 8.0 3.9 5.1 6.2 批间精度 CV% 8.9 6.3 9.2 5.5 7.2 5.8 灵敏度 提取所得的最低浓度内部血清校准品的色谱图如下。各色谱图标记了化合物名称、峰间信噪比(SNR)和浓度。所有响应均高于检测限(SNR5：1)，因此，本方法可检出维生素D严重缺乏乏患者的维生素D水平(<6ng/mL)。 总结 沃特世开发了一种利用UPLC-MS/MS分析血清中250HD2和250HD3的方法。具有良好的线性、灵敏度和精度。本方法与传统的免疫测定法相比，可提供更加可靠的结果。UPLC-MS/MS能够准确可靠地测定血清中的250HD2和250HD3，防止误报接受D2补充治疗的患者体内的维生素D总体浓度。 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-6156 2666 广州：020-28295999 ( 成都：028-67653588 ) Waters， ACQUITY UPLC， ACQUITY， Xevo， UPLC和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。QuanLynx和ApexTrack是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 免费售后服务热线：800(400)820 2676WwW.waters.com 使用LC-MS/MS检测血浆中儿茶酚胺代谢物变肾上腺素类激素 背景 血浆变肾上腺素类激素通常被作为多种神经内分泌系统肿瘤的诊断指征进行测定。更具体而言，在患有神经嵴组织或肾上腺副神经节瘤的患者中，变肾上腺素中的儿茶酚胺类激素的含量会明显增加。血浆中变肾上腺素类激素水平的升高通常用于诊断肿瘤存在与否，并在某些情况下能诊断肿瘤的位置。高血压通常是神经内分泌肿瘤的症状之一。免疫学的方法不能用来检测儿茶酚胺类激素，因此，许多临床实实室会利用LC-MS技术，通过筛选血浆变肾上腺素类激素水平高的高血压患者，进一步确认是否存在神经内分泌肿瘤。 Analyte Pheos confirmed outside Sensitivity Specificity RI(%) (%) (%) U catecholamines 78.6 78.6 87.8 P catecholamines 78.6 78.6 70.7 U metanephrines 85.7 85.7 95.1 P metanephrines 100 100 97.6 沃特世开发了一种同时准确测定血浆中的变肾上腺素和去甲变肾上腺素的方法。这些关键生物标记化合物的测定结果能为临床医生筛查有关神经内分泌肿瘤的存在、位置以及类型提供宝贵信息。 解决方案 LC系统： ACQUITY UPLC 质谱仪： Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY@ Atlantis HILIC Silica， 2.1 x50 mm， 3.0 pm (PN：186002011) 固相萃取： Oasis WCX uElution 固相萃取板 结果 色谱图 变肾上腺素和去甲变肾上腺素及其对应内标的色谱图。 回收率 加标血浆样品浓度1.0，5.0， 10，50， and100 nmol/L(每个浓度n=5)平均回收率变肾上腺素：104.0%，去甲变肾上腺素：102.8%。 重现性 2个水平质控20天重复进样。 (nmoVL) within between Total imprecision LOW 0.43 6.9 0.8 7.0 HIGH 3.86 5.1 2.8 5.8 NorMetanephrine Control Mean %CV (nmol/L) within between Total imprecision LOW 0.92 1.5 9.7 15.1 HIGH 20.7 4.1 6.1 7.3 总结 沃特世开发了一种同时检测血浆变肾上腺素和去甲变肾上腺素类激素的方法。SPE样品制备与LC-MS分析的结合，使这些重要的血浆变肾上腺素类激素的分析更为灵敏且高效。能够帮助临床筛查嗜铬细胞瘤。 沃特斯中国有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 Waters， ACQUITY UPLC， Xevo， Atlantis 和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。Masstrak是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 C2017沃特世公司中国印刷 沃特世科技(上海)有限公司 上海：021-61562666 广州：020-28295999 免费售后服务热线：800(400)8202676 Waters 使用LC-MS/MS检测血浆中醛固酮 背景 醛固酮，一种由肾上腺产生的类固醇激素，有助于调节体内钠和钾的浓度水平，从而通过激素调控血压并达到体液和血液电解质的平衡，为肾素-血管紧张素系统的一部分。由于肾上腺皮质的增生、腺瘤或癌变都可引起醛固酮分泌过多，称为原发性醛固酮增多症，充血性心力衰竭、肝硬化腹水、肾病综合征、特发型水肿、肾动脉狭窄或缺血以及失盐性肾病或肠病等多可引起血浆醛固酮增多，称为继发性醛固酮增多症。妊娠、大量出汗以及使用女性避孕药和雌激素时也可使醛固酮增高。垂体前叶功能减退症、肾上腺皮质功能减退症醛固酮水平均明显降低。选择性低醛固酮症由于肾脏分泌肾素缺乏，而出现低肾素、低醛固酮症。水摄入较多或钾摄入不足，以及应用利血平、心得安等药物都可引起醛固酮降低。 准确测定血浆中低浓度水平的类固醇激素(如醛固酮)是一件非常困难的事情。类固醇激素会与其他结构类似的相关类固醇发生抗体交叉反应，在较低浓度下可变性更高，因此许多现有检测方法都缺乏针对性。常规检测方法通常需要执行大量耗时的萃取和提纯步骤，然后进行衍生化分析。鉴于以上种种问题，许多实验室都转向使用LC-MS，这种方法可为类固醇激素的测定提供必要的灵敏度和特异性。然而，即便采用LC-MS，醛固酮的测定仍然极具挑战，因为其在血浆中的含量极低并且在质谱仪中很难被离子化，让分析变得尤其困难。沃特世开发了一种用于分析血浆中醛固酮的临床研究学方法。该方法采用SPE的前处理方式与LC-MS系统相结合，用于醛固酮的测定。 解决方案 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： XevoTQ-S 色谱柱： ACQUITY CORTECS UPLC BEH C ， 2.1x 100 mm， 1.6 pm(PN：186007095) 样品制备： Oasis MAX pElution固相萃取板 结果 如图1所示，醛固酮及其代谢前体18-羟基皮质酮实现基线分离，证明此色谱柱具有良好的色谱选择性。当样品羊的18-羟基皮质酮含量为60 nmol/L时，可在醛固酮-4H，内标的MRM谱图中检测到其同位素离子，因此因须分离18-羟基皮质酮。此外，当强的松浓度为1 umol/L时会对醛固酮产生离子抑制作用，因此还需分离强的松。由于实现了基线分离，我们可以单独定量醛固酮。 图1.使用CORTECS UPLC C 色谱柱分离醛固酮，醛固酮H，和18-羟皮质甾酮。 对三种浓度(99，500和2000pM)的醛固酮QC样品进行进样，三个浓度水平五天内每天两次重复进样三次(n=30)评价重复性和精密度。结果如下。 Total QC precision(RSD) QC repeatability(RSD) Compound Low Mid High LOW Mid High Aldosterone 9.8% 7.1% 4.8% 8.2% 7.0% 3.9% 总结 沃特世开发了一种用于测定血浆中醛固酮的高效方法，该方法应用了LC/MS/MS和SPE前处理。此方法仅使用200uL的样品即可在低生理浓度的(42pmol/L)醛固酮分析中达到足够的分析灵敏度。由于高选择性的色谱分离，以及通过阴离子交换SPE方法去除干扰物，此法可提供干净的色谱图，有助于在整个浓度范围内准确定量醛固酮。 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 Waters， ACQUITY UPLC， Xevo和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 O2017 沃特世公司中国印刷 免费售后服务热线：800(400)8202676WWW.Waters.com Waters 使用LC-MS/MS进行新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查 背景 先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是常染色体隐性遗传病，由于皮质激素合成过程中所需酶的先天缺陷所致。皮质醇合成不足使血中浓度降低，由于负反馈作用刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素增多，导致肾上腺皮质增生并分泌过多的皮质醇前身物质。主要表现的症状有失盐症群、雄激素过多症群(女性男性化和男性性早熟)、高血压伴有低血钾、男性女性化等。21-羟化酶缺乏是先天性肾上腺皮质增生症中最常见的一种，由于皮质醇合成分泌不足，170-羟孕酮(17-0HP)和雄烯二酮(A4)合成过多，有男性化和失盐表现。出现低血钠、高血钾、盾环衰竭、失盐危象可发生与生后数周内，危及生命。 通常通过免疫学方法定量17-0HP来诊断CAH。与其他新生儿筛查实验相比，免疫学筛查21-CAH的特异性差，有很高的假阳性率，需要进行二线检测验证。这是由于与17-0HP之外的其他类固醇发生了交叉反应，特别是对于一些早产儿和危重新生儿。本研究的目的开发一种简单、快速的二线检测方法来验证CAH。使用少量血浆能特异性灵敏地对皮质醇、雄烯二酮、17-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、21-羟孕酮、皮质酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮、睾酮、硫酸脱氢表雄酮等定量。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo@TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3， 2.1 x50 mm， 1.8pm(PN：186003538) 样品制备： Oasis PRiME HLB uElution (PN：186008052) 结果 能够同时分析11种涉及先天性肾上腺皮质增生代谢的类固醇激素。其中17-羟孕酮和21-羟孕酮，睾酮和其异构体表睾酮能够通过色谱将其分离，表明该色谱柱具有良好的色谱选择性。 图1.使用ACQUITY UPLCHSS T3 色谱柱分析类固醇激素的色谱图。 每天两次，重复五天分析三个不同浓度的质控(QC，n=30)作为总精密度，三个不同浓度QC重复分析三次作为重复性评价。睾酮和雄烯二酮的低、中、高QC浓度分别为0.52、5.2和35nmol/L，硫酸脱氢表雄酮的低、中、高QC浓度为0.41、4.1和27 nmol/L。所有分析物的总精度和重复性均s6.3%，见下表。 Compound Total QC precision(RSD) QC repeatability(RSD) LOW Mid High LOW Mid High lestosterone 4.7% 3.3% 3.8% 3.6% 2.0% 3.4% Androstenedione 6.3% 2.6% 4.6% 5.2% 2.3% 3.9% DHEAS 3.3% 3.0% 3.9% 2.1% 1.8% 2.7% 表1.睾酮、雄烯二酮和硫酸脱氢表雄酮的总精密度和重复性。 总结 使用UPLC@-MS/MS开发一种CAH的二线检测方法。利用固相萃取的前处理方法和MRM质谱检测分析血浆中化合物(皮质醇、雄烯二酮、17-羟孕酮、21-和11-脱氧皮质醇等等)，并评估了方法的线性、准确度、精密度。当分析具有相同分子量的内源性化合物时，UPLC提供卓越的色谱分离度。 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE， 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 Waters， ACQUITY UPLC， ACQUITY， Xevo， UPLC和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其蛇所有商标均归各自的拥有者所有。 免费售后服务热线：800(400)820 2676 C2017沃特世公司中国印刷 使用LC-MS/MS检测血清中睾酮和雄烯二酮 背景 睾酮是人体最主要的雄性激素，属类固醇激素，是促进男性内外生殖器发育，维持男性性功能及第二性征的重要激素。不论是男性或女性，它对健康有着重要的影响，包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等重要生理作用。如果女性睾酮长期处于过高水平，雌激素水平过低，会抑制促卵泡激素水平，引起卵巢卵泡不能发育成熟，不能排卵，而形成囊状卵泡，最后成为多囊卵巢综合征，而导致不孕症。此外，睾酮高还会导致女性体毛增多、变黑，男性化特征明显。测定睾酮水平是判断性激素紊乱疾病的常用临床检验方式。 一直以来，人们都采用免疫检测方法来分析睾酮。然而，有研究表明，由于会与结构相似的类固醇激素(即二氢睾酮)发生交叉反应，这些免疫检测方法往往缺乏专属性，而这会极大地影响检测的精密度和准确度，分析血清样品中的低浓度睾酮时尤其如此， GC-MS分析需要衍生步骤或者复杂长时间的样品制备。本研究中，沃特世开发一种检测睾酮的方法，通过LC-MS/MS平台利用色谱分离和选择性MRM来区分结构相似的类固醇，为上述问题提供了解决方案。 解决方案 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLCHSSC SB， 2.1x50 mm， 1.8 um(PN：186004118) 样品制备：Oasis MAXuElution固相萃取板 结果 睾酮和其前体雄烯二酮是内源性类固醇激素，具有促进和维持是性征的作作。睾酮和其异构体能够基线分离。 前处理采用Oasis MAX固相萃取，其选择性优于其它样品提取技术，能够提升睾酮ESIMS分析的灵敏度。Oasis MAX uElution板还去除了血清样品的定性离子谱图中明显存在的一种干扰物(如图1所示)。这种选择性有效改善了定量与定性离子比率的测定准确度以及峰积分重现性。 图1.使用Oasis MAX uElution板、Oasis HLB uElution板和蛋白质沉淀法提取血清样品中的睾酮并进行分析得到的定性离子MRM色谱图。 采用CDC激素标准化样品评估睾酮检测方法的准确性， CDC样品的赋值与计算值具有良好的相关性r²=0.999，平均偏差3.3%在±6.4%允许偏差限度内。 总结 本研究开发了一种用于临床研究的LC-MS/MS睾酮和雄烯二酮分析方法。该方法使用96孔OasisMAX uElution板从血清中提取睾酮，能够去除低生理浓度睾酮样品中的干扰物，实现灵敏的血清睾酮分析(LLOQ0.17 nmol/L)， 在整个线性范围内具有出色的重现性(RSDs5.0%)。简单的样品制备方法不需要进行衍生化，分析时间仅需3.3分钟。 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-61562666 广州：020-28295999 成都：028-67653588 Waters， ACQUITY UPLC， Xevo， ACQUITY 和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。Masstrak是沃特世公司标商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com 使用LC-MS/MS检测血浆中雌二醇 背景 雌激素，雌二醇，是一类有广泛生物活性的类固醇化合物，主要由卵巢、滤泡、黄体及妊娠胎盘生成，它不仅有促进和维持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并对内分泌系统、心血管系统、肌体的代谢、骨骼的生长和成熟，皮肤等各方面均有明显的影响，测定雌激素对妇科疾病有一定价值。更年期综合症、动脉硬化、脑血管阻塞、骨质疏松症、早老性痴呆症、怠倦、腰痛、肩酸、性冷淡、月经不调、不孕症，乳房发育不良、皮肤干燥、皱纹、黄褐斑等等都与雌激素分泌低下导致内分泌失调有关。雌激素也会对男性生殖系统产生明显影响，包括影响雄激素的水平，引发睾丸组织结构变化，引起睾丸癌，降低精液中的精子数量，造成男性乳房发育，导致内分泌紊乱。雌二醇偏高可能是由于卵巢疾病，心脏病，系统性红斑狼疮，肝硬化，男性肥胖症等原因。雌二醇偏低可能是由于卵巢疾病，垂体性闭经或不孕，甲低或甲亢，柯兴综合征等疾病。 雌二醇的检测常规采用免疫学方法，但是免疫学的方法有很高的交叉反应，结果不准确，因此需要灵敏高、选择性好的方法测定雌二醇。沃特世开发了固相萃取(SPE)和LC-MS/MS的方法分析人体血浆中低浓度的雌激素。 解决方案 LC系统： 沃特世ACQUITYUPLC系统 质谱仪： Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3， 2.1 x100 mm， 1.8 um (PN：186003533) 固相萃取： Oasis MCX uElution固相萃取板 结果 使用ACQUITY UPLC和ACQUITY UPLC HSS 1.8pm色谱柱出色地分离了样品内源性化合物中的雌二醇。雌二醇保留时间为3.3 min。图1展示了血浆中浓度为定量下限(LLOQ)的雌二醇色谱图。 图1.2pg/mL血浆中雌二醇的UPLC-MS/MS色谱图。 该方法在2-160pg/mL的线性范围内， r2为0.992，相对偏差在±12%范围内。除了能够满足高灵敏度和高专属性需求之外，该方法运行时间仅为6 min， 可实现高通量分析。 成年男性的血清雌二醇低限和高限在50-200pmol/L范围内，而成年女性为70-500pmol/L。因此，检出人血浆中极低浓度雌二醇的能力至关重要。结合SPE样品制备、ACQUITY UPLC以及Xevo TQ-S的解决方案能够在雌二醇分析中轻松达到2 pg/mL的LLOQ。 总结 结合基于Oasis MCX的高度特异性固相萃取方法、采用ACQUITY UPLC的高分离度UPLC分离方法，以及固有灵敏度极高的Xevo TQ-S， 我们开发出了一种高灵敏度的血浆雌二醇定量方法。该方法的LLOQ可达2 pg/mL，并且具有出色的精度和稳定性。 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 成都：028-67653588 Waters， ACQUITY UPLC， Xevo和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。Masstrak是沃特世公司标商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 C2017 沃特公公司中国印刷 免费售后服务热线：800(400)820 2676Www.waters.com 使用LC-MS/MS同时检测四种免疫抑制剂 背景 免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。常用的免疫抑制剂包括他克莫司、环孢霉素A、西罗莫司、依维莫司等。免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。由于其治疗窗窄，在药动学和药效学上存在着明显的个体差异，且血药浓度与给药剂量间相关性不佳，给临床治疗增加了相当的难度。因此，免疫抑制剂在临床应用中需进行治疗药物监测，所测值作为临床评价疗效及毒副反应的指标。 传统免疫学方法进行血药浓度监测时特异性较差，不能完全区分免疫抑制剂与其代谢物。例如： FK506目前已被发现至少有9个体内代谢物，代谢产物互为同分异构体，并且部分代谢产物具有免疫活性。这些代谢物与母药存在交叉免疫反应，使测得值高于实际值，重现性差。检测所需时间较长。另外，新的免疫抑制剂如依维莫司， LC-MS/MS可能是目前唯一能够采用的方式。LC-MS/MS相比操作简单、分析速度快，所需样品量少，灵敏度高，特异性好，结果更加可靠，重现性好，能完全区分药物本身及其代谢产物。 解决方案 结果 特异性 LC-MS/MS方法特异性好，相比于免疫学方法能区分他克莫司与其代谢物。 色谱图 如图是最低浓度全血校准品的色谱图，所有响应均大大高于检出限。 线性和精密度 使用Chromsystems校准品所有化合物均有良好的线性校准曲线(r2>0.995)。使用Chromsystem质控品评价日内精确度(n=5)。使用Recipe质控品评价日间精确度(n=5)。日内和日间精密度的变异系数均<10%。 Compound ControL Mean Conc(ng/mL) St Dev %CV Level 1 2.9 0.1 4.9 Tacrolimus Level 2 7.1 0.3 4.6 Level 3 15.3 0.7 4.8 Level 4 26.9 0.9 3.3 Level 1 2.4 0.3 9.4 Sirolimus Level 2 9 0.3 3.8 Level 3 15.5 0.5 3.3 Level 4 27.9 1.2 4.2 Level 1 2.4 0.1 5.4 Everolimus Level 2 4.4 0.3 6.8 Level 3 8.1 0.7 8.2 Level 4 23.4 1.5 6.2 Level 1 102.3 5.1 4.9 Cyclosporin A Level 2 247.7 10.2 4.1 Level 3 561.6 16.2 2.9 Level 4 1584.7 66.5 4.2 表1.使用Chromsystems质控品评价日内精确度(n=5)。 Compound Linearity(r) Control Mean Conc(ng/mL) St Dev %CV LOW 3.6 0.1 3.6 Tacrolimus 0.9987 Medium 7.3 0.2 3.2 high 14.2 0.2 1.6 LOW 4.5 0.2 4.4 Sirolimus 0.9975 Medium 12.9 0.8 6.1 high 25.2 1.5 5.8 LOW 3.6 0.3 7.9 Everolimus 0.9978 Medium 12.0 0.5 4.6 high 20.1 1.3 6.4 LOW 52.2 2.7 5.2 Cyclosporin A 0.9966 Medium 105.5 4.4 4.2 high 217.8 9.2 4.2 表2.使用Chromsystems校准品评价线性以及使用Recipe质控品评价日间精确度(n=5)。 总结 Xevo TQD能够在一次分析检测中通过简单样本制备而对多种免疫抑制剂进行定量。分析物可在规定的检出限内被检出并呈线性，也具有良好的日内和日间精确度。与传统免疫学方法相比，沃特世开发的LC-MS/MS方法对于移植患者免疫抑制剂血血药浓度监测有更好地特异性。 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-6156 2666 广州：020-28295999 Waters 和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其蛇所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 O2017 沃特公公司中国印刷 免费售后服务热线：800(400)820 2676WWw.waters.com 使用LC-MS/MS分析血清中多种精神治疗药物 背景 精神性治疗药物常用于治疗抑郁，焦虑，精神分裂和进食障碍症。近年来，抗抑郁药的使用呈现出逐年增加的趋势。抗抑郁药同一剂量可能出现较大的血药浓度差异。临床发现，同等剂量时有些患者血药浓度较低，有些则较高，少数病人可能严重中毒，因此需要进行治疗药物的监测，随时对治疗过程中药物剂量优化，调整患者的剂量，最大限度发挥药物治疗效果又避免毒副作用。通过治疗药物监测还可以及时发现病人在治疗过程中是否停药、减量或超量用药，帮助病人正确地认识药物，正确地服用药物，保证药物发挥应有的疗效。对抗抑郁药进行治疗药物监测是提高治疗有效性和安全性的有效手段。精神治疗性药物的分析除了在临床上，在司法毒物学也占有重要地位。 沃特世开发一种简单的能同时对人血清中多种精神治疗药物定量检测的UPLC-MS/MS方法，并用于实际样品检测。这个新方法节省了总体分析时间，因而提高了样品通量及实验室效率。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo@ TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC BEHC，，2.1x100 mm， 1.7 pm(PN：186002352) 样品制备方法 简单的蛋白沉淀步骤，人血清中加入含3种气代内标物质(氯米帕明-D3，多噻平-D3和丙咪嗪-D3)的乙腈。样品经涡旋混合后，在12000rpm下离心10 min。 上清液加入pH45mM的乙酸，最后涡旋混匀。 结果 表1总结了监测药物母离子、子离子和质谱条件。每个化合物都由定量离子和定性离子进行监测。 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 锥孔 电压(V) 碰撞电压 (eV) 阿米替林 278 91 35 25 氯米帕明 315 86 35 20 去甲氯米帕明 301 72 35 15 氯米帕明-d3 318 89 35 20 地昔帕明 267 72 35 15 多噻平 280 107 35 25 多噻平-d3 283 107 40 25 丙咪嗪 281 86 30 15 丙咪嗪-d3 284 89 30 15 去甲替林 264 91 35 20 普罗替林 264 155 40 20 三甲丙咪嗪 295 100 35 15 西酞普兰 325 109 40 25 氟西丁 310 148 25 8 诺氟西丁 296 134 20 5 氟伏沙明 319 71 30 15 帕罗希丁 330 192 45 20 舍曲林 306 159 25 25 文拉法辛 278 58 30 20 曲拉唑酮 372 148 35 35 向空白血清中加入一系列浓度的精神治疗药物制成的标准品(1，2，5，10，50，100和200ug/L)。所有化合物的响应值在评估范围内都具有线性关系(相关系数>r=0.996)。 所有化合物的检测限均在0.1-1.0 ug/L范围之内，低于分析所要求的最低限度。图1显示一个病人的样品中，含有较低治疗浓度的西酞普兰。西普酞兰的浓度测定结果为29.2pg/L。 图1对一位病人西普酞兰较低治疗浓度(~20ug/L)血样分析的MRM谱图。多噻平-D3(下图)为内标。西普酞兰的浓度测定结果为29.2pg/L。 批内精密度和准确度通过向空白血清中(n=4)加入低中高(10，50 and 150 ug/L)三种浓度的精神治疗药物来验证。质控控也用上述的方法进行处理。日内精密度和准确度分别为CV<15%和>88%，结果都符合要求。蛋白沉淀法非常有效，分析样品回收率>93%。 总结 精神类药物一旦使用，无论是否进行治疗药物监测，还是医学上或是司法上的需求，都增加了其对分析的需求。因此，需要一种简单，快速的药物分析检测手段。建立的方法学显示8分钟内色谱就能够对精神治疗药物进行准确的筛查和定量分析。这种方法也由此成功应用到了临床样品的分析上。通过蛋白质沉淀技术使得样品前处理速度加快，加上UPLC(时间缩短近一半)的应用，使整个分析过程所需时间大大缩短。UPLC-MS/MS方法既提高了实验室效率，也使处理样品的数量大大增加。这个应用证明了该方法对大量精神治疗药物进行定量分析的可行性。 Waters 使用LC-MS/MS分析血样中多种抗癫痫药物 背景 癫痫，是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。据中国最 新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为7.0%o，年发病率为28.8/10万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为4.6%o。据此估计中国约有900万左右的癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。在癫痫发作的治疗中，抗癫痫药物有特殊重要的意义。临床上通过抗癫痫药物血药浓度的测定可以了解药物应用剂量与血中药物浓度、疗效、药物毒性反应以及药物的相互作用等方面的问题，评价药物是否达到有效剂量的关键指标，使癫痫的治台更科学、更有效，同时也可以尽量减少药物的毒副作用。抗癫痫药剂量太小不能控制病情，如果剂量太大会产生副作用或毒性，治疗有较大的个体差异，而且对于一些难治愈的患者需要联合用药。为了使抗癫痫效果达到最佳，使其副作用减至最低，进行药物监测非常必要。建立可靠的血药浓度测定方法是药物监测的关键。可以采用GC、LC、免疫法进行治疗药物监测，但是免疫方法并不适用于所有的抗癫痫药。本研究开发了使用UPLC-MS/MS方法同时分析一系列抗癫痫药以及部分有活性的代谢物。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo@ TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC BEHC 2.1x50 mm， 1.7 pm(PN：186002350) 样品制备方法 血清/血浆样品，加入甲醇，涡旋混合，离心(13000rpm， 5 min)沉淀蛋白。之后上清液用纯水稀释上样。 结果 使用UPLC分析24种抗癫痫药物分别是氨己烯酸、普瑞巴林、加巴喷丁、左乙拉西坦、乙琥胺、唑尼沙胺、扑痫酮、非氨酯、拉莫三嗪、苯巴比妥、去甲基甲琥胺、丙戊酸/丙戊酸钠、托吡酯、10-羟基卡马西平、环氧卡马西平、苯妥英、卡马西平、氯硝西泮、去甲基氯巴占、氯巴占、噻加宾、去甲基地西泮以及地西泮。 环氧卡马西平和苯妥英的相对分子质量相同，母离子均为m/z253。环氧卡马西平产生主要的离子碎片是m/z180， 还有次要离子碎片m/z 182。苯妥英主要的碎片离子是m/z 182。当苯妥英从色谱柱洗脱后会在m/z182有信号响应。然而，当环氧卡马西平洗脱后由于苯妥英和环氧卡马西平有相同的母离子和子离子所以两个MRM通道均有信号响应。因此，需要用色谱将两种化合物分离。 使用ES+和ES-离子化模式能够离子化24种抗癫痫药，丙戊酸和丙戊酸钠溶解在水溶液中形成相同的酸性基团，只需要一对MRM即可。 图1.24种抗癫痫药色谱图。 分别分析抗癫痫药物在水溶液中和基质中的校准曲线，所有化合物水溶液校准曲线呈线性(0、1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000 ng/mL， r>0.99)， 平均精密度<10%RSD。基质校准品的线性和精密度如表1所示。 Compound Linearity(C) Control Expected(ug/mt) %CV Ethosuximide 0.98 Control 1 43.9 12.9 Control 2 88.6 5.3 Control 3 120.0 2.6 Primidone 0.99 Control 1 4.3 5.8 Control 2 17.8 2.6 Control 3 26.7 3.7 LamotrigIne 0.99 Control 1 2.9 4.9 Control 2 9.8 2.0 Control 3 13.9 2.7 Phenobarbitone 0.99 Control 1 9.5 10.0 Control 2 34.6 5.8 Control 3 43.2 5.6 Valproic acid 0.996 Control 1 38.4 4.9 Control 2 90.1 1.5 Control 3 136.0 3.1 Carbamazepine epoxide 0.99 Control 1 2.0 3.7 Control 2 4.9 1.7 Control 3 7.0 2.4 Phenytoin 0.99 Control1 4.8 9.7 Control 2 17.9 5.0 Control 3 26.7 5.2 Carbamazepine 0.994 Control 1 4.8 6.0 Control 2 13.5 2.9 Control 3 18.0 2.4 表1.血清质控中8种抗癫痫药线性和精密度(n=5)。 总结 利用不同流动相改性剂调整色谱行为，包括降低或者升高pH，使用不同浓度的缓冲溶液。最终确定采用乙酸铵作为改性剂。检测的24种抗癫痫药物，包括酸性(如：丙戊酸)，弱碱性(如：卡马西平)，两性离子(如：氨己烯酸)。抗癫痫药的治疗范围基本在ug/mL水平，在化合物检测限以上。氨己烯酸不能在色谱保留，在柱死体积会洗脱下来。所以在分析血清中氨己烯酸时耐用性可能会受到离子抑制或患者可变性的影响。 沃特世开发了检测血清/血浆中24种抗癫痫药的方法。每个样品检测时间小于10 min。 由于UPLC具有出色的色谱分离度和速度，束及MS/MS的快速扫描能力(最小驻留时间1 ms， 极性切换20ms)，使用UPLC-MS/MS系统定量24种抗癫痫药有良好的检测限、线性和重现性，化合物检测灵敏度和特异性良好，适于日常对癫痫病患者进行治疗药物监测，能够在一次分析中监测所有的抗癫痫药物。 使用LC-MS/MS分析血样中甲氨蝶呤 背景 甲氨蝶呤为抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。主要适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部，瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、肝癌、顽固性普通牛皮癣、系统性红斑狼疮、皮肌炎等自身免疫病。传统使用免疫分析法来测定甲氨蝶呤浓度，但是存在与非活性代谢物2，4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)发生交叉反应。对于CNS淋巴瘤患者，使用大剂量甲氨蝶呤(>500 mg/m²)的同时通常都会配合使用羧肽酶或甲酰四氢叶酸解救疗法将甲氨蝶呤的浓度降至1 mmol/L以下。由于DAMPA浓度升高，免疫分析技术可能会高估羧肽酶给药后的甲氨蝶呤浓度，因此在进行高剂量甲氨蝶呤的临床试验时，使用选择性好的检测方法非常重要。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo@ TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITYUPLC HSSCSB(PN：186004117) 样品制备方法 50uL样品，加入含有含有内标的甲醇溶液进行蛋白质沉淀，旋涡混合后离心2 min。取上清液加入水稀释后经过UPLC-MS/MS系统分析。 结果 甲氨蝶呤与其主要代谢物7-羟基甲氨蝶呤和DAMPA实现了色谱分离。图1显示最低浓度的甲氨喋呤和及其代谢物。 图1.血浆中甲氨喋呤(0.025umol/L)， 7-羟基甲氨蝶呤(5umol/L)和DAMPA(5umol/L)的色谱图在分析浓度为100 pmol/L的甲氨蝶呤血浆样品之后，没有系统残留污染。 五天内每天分析四个浓度的QC样品(每个浓度五个重复样， n=25)， 以此作为该方法的总精度。每个QC水平重复五次作为重复性评价。表1显示了这些实验的结果，四个浓度的甲氨蝶呤总精度和重复性RSDs5.5%。 Nominal concentration Total precision Repeatability (umol/L) (%RSD) (%RSD) 0.1 5.1 4.0 2.5 4.6 1.8 10 5.4 2.9 75 5.5 2.7 表1.甲氨喋呤总精密度和重复性。 从羧肽酶给药前27小时开始到给药后147小时，从受试者体内抽取一系列血浆样品测定甲氨蝶呤浓度。免疫分析法与UPLC-MS/MS方法检测的甲氨蝶呤结果在羧肽酶给药后45h之内存在36%~99%的差异；差异的大小与DAMPA峰面积成正比。 图2.比较使用UPLC-MS/MS和免疫分析法测定接受羧肽酶治疗的受试者血浆中的甲氨蝶呤浓度。 总结 使用LC-MS/MS能够对血浆和血清中甲氨蝶呤进行分析，该方法灵敏度高、选择性好。样品前处理过程快速且经济，仅使用50uL样品即可对低生理浓度的(0.025 umol/L)甲氨蝶呤检测。该方法可同时实现甲氨蝶呤及其主要代谢物的色谱分离，能够在整个浓度范围内精准定量甲氨蝶呤。 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 成都：028-67653588 Waters 和The Science of What's Possible是沃特世公司的注册商标。 其蛇所有商标均归各自的拥有者所有。 免费售后服务热线：800(400)820 2676 C2017沃特世公司中国印刷 使用LC-MS/MS分析血清中抗真菌唑类药物 背景 三唑类抗真菌药物是临床应用最为广泛的抗真菌药物，三唑类抗真菌药物相对安全，作用广泛，口服和非口服给药都具有一定的疗效。伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑的血药浓度个体差异大，并且抗真菌药物血药浓度与疗效和毒副作用有相关性，有治疗药物监测(TDM)的必要。本文介绍了一种分析血清中抗真菌唑类的方法。尽管微生物检测法可测定抗真菌唑类药物，但对于伊曲康唑而言，其高活性的代谢物羟基伊曲康唑会导致实际检测浓度偏高。类似地，同时使用两种或两种以上药物也会影响微生物检测法的适用性。此外，目前还没有成熟的羟基伊曲康唑检测方法。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC BEHCg， 1.7 um， 2.1 mmx30 mm(P/N 186002349) 样品制备方法 50uL样品，加入含有内标的甲醇溶液进行蛋白质沉淀，旋涡混合后离心2 min。取上清液加入水稀释后经过UPLC-MS/MS系统分析。 结果 除羟基伊曲康唑和泊沙康唑外(这两种药物分子量不同，通过不同MRM通道即可实现分离)，其它所有化合物都实现了色谱分离。图1为中浓度校准品(50pg/mL氟康唑，5ug/mL其它所有化合物)的色谱图。未发现任何化合物残留。 图1.使用ACQUITY UPLC BEHC色谱柱分离氟康唑、羟基伊曲康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的色谱图。 在五天内每天分析三个浓度的QC样品(每个浓度五个重复样， n=25)，以此作为该方法的总精度。每个QC水平重复五次作为重复性评价。如表1所示，低浓度(1.5ug/mL氟康唑， 0.15 ug/mL其它化合物)、中浓度(20ug/mL氟康唑， 2ug/mL其它化合物)和高浓度(80ug/mL氟康唑， 8ug/mL其它化合物)浓度度的总精度和重复性为RSD≤11.5%。 Compound Total QC precision(RSD) QC repeatability(RSD) LOW Mid High LOW Mid High Fluconazole 2.7% 2.6% 2.6% 2.6% 1.8% 2.6% Hydroxyitraconazole 11.5% 5.4% 5.1% 10.0% 3.0% 4.0% traconazole 8.9% 5.1% 6.4% 8.6% 3.0% 2.6% Posaconazole 7.7% 3.9% 4.5% 5.2% 2.9% 2.4% Voriconazole 2.6% 2.4% 2.9% 1.5% 2.1% 1.7% Voriconazole-N-Oxide 5.4% 1.9% 3.4% 3.5% 1.9% 2.7% 表1.氟康唑、羟基伊曲康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和伏立康唑氮氧化物分析的总精度和重复性。 分析20个美国国家参考实验室赋值的羟基伊曲康唑血清样品。结果表明沃特世UPLC-MS/MS方法与参考实验室方法具有良好的一致性。 总结 UPLC-MS/MS方法可以分离伊曲康唑和伏立康唑及其代谢物，为临床研究中的抗真菌化合物分析提供了一种可靠的方法。 该方法具有高分析灵敏度，仅使用50pL样品即可在较宽的线性范围内(200倍)分析低浓度的氟康唑(0.5 ug/mL)、羟基伊曲康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑和伏立康唑氮氧化物(浓度均为0.05 ug/mL)， 而且样品制备过程简单、快速、经济。 Waters 使用LC-MS/MS分析血浆中同型半胱氨酸 背景 高半胱氨酸(Hcy)，或称为同型半胱氨酸或同半胱氨酸， Hcy是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物，在体内经蛋氨酸脱甲基化生成，主要通过再甲基化和转硫途径代谢， Hcy可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子。Hcy水平升高被认为是动脉粥样硬化性疾病独立的渐进性致病因素，过多的Hcy在血液中蓄积，会产生兴奋性毒性和神经毒性，直接损伤神经元，同时通过氧化应激反应，损伤血管内皮，导致动脉粥样硬化，对于预测心脑血管病、糖尿病、恶性肿瘤、老年性痴呆等多种疾病的发病危险具有重要意义。很多大型综合性医院和心脏专科医院已将它列为心脑血管疾病的常规检测项目，并得到了临床医生和社会公众的广泛关注和认可。Hcy的正常参考值随测定方法和种族人群的不同而有所不同。研究表明： Hcy每升高5 umol/L脑卒中风险升高59%，缺血性心脏病风险升高32%； Hcy每降低5 umol/L脑卒中风险降低24%，缺血性心脏病风险降低16%。Hcy水平与心血管事件风险呈正相关。 目前，有很多方法来检测Hcy，包括HPLC，酶联免疫法， GC/MS以及LC-MS/MS。最新检测Hcy方法是使用同位素标记内标的LC-MS/MS方法。这一方法不需要衍生，因此相比现有技术增加样品通量。沃特世开发了LC-MS/MS的方法及分析Hcy，只需很少的样品量，不需要离心或者转移，就能进行高通量的样品制备。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： Waters Symmetry@C，， 2.1x100 mm， 3.5 um(PN：WAT058961) 其他： 96孔微孔板 结果 血浆中高半胱氨酸校正曲线(0，5，10，15，25和50 umol/L)r=0.9981。使用两个不同浓度样品14.6和37.7uM验证方法重现性，日间精密度(n=5)CV分别是5%和8%。日内精密度(n=10)CV均<2%。 图1.浓度10uM的d4-高胱氨酸(A)和高胱氨酸(B)的MRM色谱图。 图2.血浆中高胱氨酸校正曲线。 使用LC-MS/MS和Abbot TDxkit两种方法分别分析患者高半胱氨酸浓度(n=50)来进行方法验证。LC-MS/MS方法与Abbot TDx kit方法结果之间有很好的相关性(r²=0.9149)，相比之下LC-MS/MS方法有微小正偏差(0.44)。 图3.比较使用LC-MS/MS和Abbot TDx kit检测高半胱氨酸。 总结 该方法能快速、准确确定血浆中高半胱氨酸，重现性好，运行时间~2 min。简单的分析方法适合非专业人员操作以及日常的高通量检测。 沃特斯中国有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 广州：020-28295999 Waters， ACQUITY UPLC， ACQUITY， Xevo， Symmetry 和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 沃特世科技(上海)有限公司 上海：021-61562666 免费售后服务热线：800(400)820 2676www.waters.com 使用LC-MS/MS分析生物样品中全谱氨基酸 背景 氨基酸是人类营养的基础，是最重要的营养成分。生理状态下，体内的全谱氨基酸处于一个平衡状态。全谱氨基酸的失衡是众多疾病的诱因或表现形式。全谱氨基酸检测可以作为健康诊断或疾病筛查的重要手段，可以为及早预防疾病、改善身体营养状态和营养补充提供参考标准。全谱氨基酸检测通过对人体内氨基酸的精确检测，揭示人体内详细的氨基酸代谢状况，从而从不同的代谢路径提示人体的健康状况。 目前，主要是阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生化方式测定氨基酸。但是这个方法仪器与方法复杂，需要经验丰富的技术人员。分析时间过长，每个样品大约需要90-120 min， 无法满足样品分析。沃特世UPLC-MS/MS的方法，研究人员可以简单、快速获得更高的分离度、灵敏度、精确度，实现最佳分析结果。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo@ TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3， 2.1x150mm， 1.8 pm(PN：186003540) 样品制备方法 样品与甲醇混合，进行蛋白质沉淀。转移10pL进行衍生化处理。 结果 20种氨基酸使用稳定同位素内标进行绝对定量，另外18种氨基酸由于没有稳定同位素内标进行相对定量。如表1所示。色谱分离得到优异的峰型，峰宽为3s。校正曲线涵盖生理范围0.2-200uM。根据FDA指导原则进行验证。例如：谷氨酸校正曲线r是0.9999， CV<10%。 Validated For Absolute Quantification Monitored For Relative Quantification L-Alanine 3-Methyl-L-histidine L-Arginine 1-Methyl-L-histidine L-Asparagine Cystathionine L-Aspartic acid DL-B-Aminoisobutryic acid L-Custine Ethanolamine L-Glutamic acid Homoserine L-Glutamine Hydroxy-L-proline Glycine Hydroxylysine L-Histidine L-Carnosine L-Isoleucine L-Citrulline L-Leucine L-Ornithine L-Lysine L-a-aminoadipic acid L-Methionine L-a-Amino-n-butyric acid L-Phenylalanine Phosphoserine L-Proline Sarcosine L-Serine laurine L-Threonine B-Alanine L-Tryptophan y-Amino-n-butyric acid L-Tyrosine L-Valine 表1.氨基酸列表。 图1.谷氨酸校正曲线和最低定低限质控(0.2uM)色谱图. 总结 沃特世开发了检测人体20种氨基酸的绝对定量方法和其他18种氨基酸的相对定量方法。每个样品的分析时间是7.5 min， 每天能够检测2块96孔板的样品。方法满足在0.2-200uM重要生理范围内的检测，重现好。这个方法为人体内氨基酸的分析提供了快速、准确的定量方法。 沃特斯中国有限公司沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 上海：021-61562666 北京：010-52093866 广州：020-28295999 ( 成都：028-67653588 ) Waters， ACQUITY UPLC， Xevo和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 香港：852-29641800 C2017沃特世公司中国印刷 免费售后服务热线：800(400)8202676WWw.waters.com Waters 使用LC-MS/MS进行法医毒理学筛查 背景 大近年来， LC-MS/MS在法医毒物学实验室的应用显著增加。对灵敏度、快速分析、选择性及简单样品前处理的高要求，使LC-MS/MS方法成为许多重要滥用药物分析的首选方法。除了安非他命、阿片类、大麻、麦角酸二乙基酰胺和可卡因等常见违禁药物外，许多处方的“合法”药物都存在药物滥用或误用的高风险，如苯二氮卓类和阿片处方药类：美沙酮和丁丙诺啡。酶联免疫法和GC-MS方法广泛应用于筛查检测，并且曾经是确证分析的主要手段。但是，现在LC-MS/MS已成为确证分析的公认技术，并且在筛查应用的使用也逐年增加。LC-MS/MS技术被广泛应用于法医毒物学实验室的定量和确证分析，尤其对于GC很难分析的极性、不挥发和热不稳定等化合物非常有用。另外，简化的前处理方法以及相对于GC-MS保留时间短等优点，使这项技术对注重工作效率和需要快速报告结果的实验室有极大的吸引力。 沃特世提供两种互补方法实现更全面的毒物筛查。一种具备出色灵敏度和选择性的目标性MRM方法，可利用每种化合物的两个离子对筛选180种重要待测物，一种包含近1000种毒物谱库的全扫描MS方法，用户可以方便地在谱库中添加数据。这些方法已成功应用在世界各地超过100间的实验室，包括此前基本完全没有LC-MS经验的实验室。 解决方案 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo TQD/Xevo TQ-S micro/Xevo TQ-S 色谱柱： ACQUITY UPLC HSSCg， 2.1 x150 mm， 1.8 pm (PN：186003534) 结果 通过目标性MRM筛查分析真实样品 目标药物的鉴别有不同环境，如急诊室住院处，这里的筛查方法需要极好的灵敏度和选择性。UPLC-MS/MS为每个化合物提供两个MRM。为每个分析物提供的预先设置的MRM条件存储在化合物数据库中，以确保灵优异的敏度。 channeis Compound Name Parent(m/z) Daughter (mz) Dwell(s) Cone(V) Collision(V) 1 Nicotne 1631 130 002 35 25 2 Sabuzimol 240.1 148.1 0.02 35 25 3 Alenolol 2672 1451 002 40 125 4 Morphine 2862 1652 002 55 40 TargetLynx软件使自动数据处理变得简单。建立样品列表来获得数据，并不需要分析者介入而自动处理数据。如图，样品中检出美沙酮及其代谢物等。 Name Trace RT Pred.RT Area 1* Area 1 Methndone 3103105.1 880 861 453948 837485 2 EDDP 2782234.2 7.85 7.48 149118 89332 3 Paracelamol 1521>110.1 1.55 1.50 55988 14049 4 Cocaine 304.2>1822 4.75 4.61 11702 1789 5 Benzoylecqonine 290.1x168.1 3.09 297 11261 4102 6 Nicstine 1631132 105 101 6143 8571 7 Caffeine 195.1>138.2 2.16 210 3BB8 889 8 Temazepam 301.1>255.1 9.48 9.34 3883 572 9 Oxazepam 287.1>241.2 8.18 8.07 2528 2126 10 Theschylline 181.11241 145 146 2255 485 11 Nordiazepam 271.1>1651 931 914| 1297| 2105 全扫描MS方法的一个主要优点是可以同时筛选大量物质，这与仅限于一组分析物的目标性MRM方法恰好相反。这种方法的另一个优点是数据不受限于采集通道的设定，因此可以为回顾性分析提供完整的数据。 下图显示了使用全扫描MS方法对一个尿液样品进行筛查的结果。在此样品中检出了代谢物N-去甲基米氮平及原形米氮平。还检出了另一种化合物赛洛唑啉。利用目标性MRM方法无法鉴定这种抗鼻充血剂，因为MRM库中还未包含该化合物。 总结 以上的两种筛查方案沃特世均提供快速开始DVD， DVD内包含采集UPLC方法， MS/MS采集方法，数据处理方法，报告导出设置，操作SOP等所需。一个简单的说明书涵盖了从最初的仪器安装(包括用系统适用性混合物进行系统充证)到实际样品的分析。这些方法能快速应用于临床，对于数据处理，沃特世软件简化实验室分析人员的工作，最大限度地降低了报告结果延迟的情况，所有提供的方法是完全可定制的，可以很容易修修，例如，增加分析物添加到现有的数据库。此外，筛查方法可添加额外的化合物信息，如离子比例，允许范围外，二级MRM来提供充分验证并且用户也可以自定义来更新谱库。 Waters 使用UPLC-Tof-MS筛查尿液中常规与新型毒品 背景 娱乐性毒品的使用在英国十分普遍，特别是对于经常出入夜总会和其他夜间娱乐场所的人群。2010/2011年The British Crime Survey估计在过去的一年中有8.8%的成年人使用违禁药物；同期，由Mixmag进行的一项在线调查则显示，经常出入夜店场所的人群的违禁药物使用率明显高于这一数字。该调查报告显示在过去一年中有50%至75%的受访者曾使用MDMA(摇头丸)、可卡因或甲氧麻黄酮。此外，伦敦一间夜总会进行的一项最新调查显示，41%的受访者声称在过去的一个月中曾使用甲氧麻黄酮。在我国，从公安部获悉，仅2014年10月1日至29日，全国就破获毒品犯罪案件10427起，缴获各类毒品9.14吨，查处吸毒人员55981人次。目前，全国登记吸毒人员276万名，按国际惯例估算实际吸毒人员超过1300万，每年消耗的毒品总量近400吨，因毒品而消耗的社会财富超过5000亿元。 一项通过混合尿液确定毒品使用情况的可行性评估研究中，实验人员在伦敦的一间夜总会使用一个改装的便携式小便器收集了一系列样本。本研究给出了基于UPLC@结合Tof-MS方法的筛查结果。凭借UPLC-Tof-MS出色的灵敏度可获得尽可能多的信息，为毒物筛查的应用提供了独特优势。通过精确质量数可判断化合物的元素组成，这在涉及新型毒物和类似物的筛查中尤其有利。 解决方案 方法 LC系统： 沃特世ACQUITY UPLC系统 质谱仪： Xevo G2-XS QTof 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS C，g，2.1x150mm， 1.8 pm(PN：186003534) 样品制备方法 将尿液样本移至样品瓶中，用流动相稀释5倍。 数据管理 使用UNIFI(简化目标性和非目标性毒物筛查流程的全新信息学平台)进行数据采集和数据处理。沃特世毒物筛查解决方案包含1300余种毒物/药物及其代谢物的数据库。 结果 使用沃特世Xevo G2-XS QTof在MS模式下采集数据，同时在低、高两种碰撞能量条件之间快速交替切换，从而提供母离子和碎片离子的精确质量数以便进一步确认。然后将采集到的数据与在相同条件下创建的包含1300多种毒物/药物及其代谢物的数据库进行比较。数据库中包含的所有化合物均具有相应的保留时间(RT)，精确母离子信息，85%以上化合物有额外的经过确证的碎片离子信息。因此可根据每种被测物的保留时间和精确母离子和多至四个碎片离子的精确质量进行鉴定。 在4个样品中共检出72种药物及其代谢物。检出药物大致可分为以下几个类别：传统娱乐性毒品，具有精神作用的新型化合物，潜在掺杂物，处方药/非处方药。4个样品各包含表1中所列的部分化合物。检出的代谢物证实受试者实际使用了毒品并代谢，而不是未使用的毒品被直接丢弃在小便器中。 表14个尿液样品中发现的常规和新型毒品。 类别 药物 检出代谢物 常规毒物 安非他命 + 可卡因 + 氯胺酮 + 甲基苯丙胺 吗啡 MDMA + 新型毒物 甲氧麻黄酮 (4-MMC) + NRG-2(4-MEC) 2-AI TFMPP + 此外，还鉴定出了一些处方药/非处方药，包括抗抑郁药、苯二氮卓类药物及其它镇静剂、抗组胺剂、抗疟药物、抗病毒药物、鼻减充血剂、镇痛药和质子泵抑制剂。下图是其中一份尿样经过MS分析和数据库匹配之后得出的筛查结果。 图1.夜店尿样4分析结果，包括：甲氧麻黄酮(4-甲基甲卡西酮)； MDMA；可卡因/可卡因代谢物和左旋咪唑；氯胺酮及其代谢物。此外，只有样品4中检出了TFMPP和4-甲基乙卡西酮(4-MEC； NRG-2)。另外，该样品中扑热息痛以及抗逆转录病毒药物阿扎那韦和奈韦拉平的筛查结果也呈阳性。 总结 大范围的筛查技术用来鉴定尿液样品中毒品促进了对娱乐性毒品区域使用特点的了解。这种混合样品提供了可行的匿名生物样本，同时避免了自我报告方法的局限性和不确定性等问题。这种以Xevo G2-XS QTof为平台的检测方法灵敏而可靠，可完成稀释尿液样品分析，并通过检索包含1300种毒理学相关化合物的大型数据库进行筛查。最后，依靠此方法可以用于毒品使用情况筛查。 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28295999 ( 成都：028-67653588 ) ( Waters， UPLC， ACQUITY UPLC， Xevo， MassLynx， UNIFI和The Science of What’s Possible是沃特世公司的注册商标。 QuanLynx和TargetLynx是沃特世 公 司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ) 免费售后服务热线：800(400)820 2676Www.waters.com ( 参考文献 ) l. The analysis of 25-hydroxyvitamin D in serum using UPLC-MS-MS. 2. Analysis of Metanephrines in Plasma by LC-MS/MS. 3. UPLC-MS-MS Analysis of Aldosterone in Plasma for Clinical Research. 4+..Analysis of Testosterone， Androstenedione， andDehydroepiandrosterone Sulfate in Serum for ClinicalResearch. 5. A Clinical Research Method for the Analysis of Serum Testosterone and Androstenedione. 6. Quantification of Estradiol at 2 pg mL Using UPLC and Xevo TQ-S. 7.. A preliminary investigation into a simple and robust protein precipitation method for the simultaneousdetermination of immunosuppressants in transplant patient blood using LC-MS/MS. 8. Quantitative analysis of multiple psychotherapeutic drugs in human serum. 9. Therapeutic drug management (TDM) of antiepileptic drugs multidrug analysis using UPLC/MS/MS. 10. UPLC-MS/MS analysis of methotrexate in plasma and serum. 11. UPLC-MS/MS analysis of azole antifungals in serum for clinical. 12. 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