营养饮料中水溶性维生素检测方案(液相色谱仪)

2 对于Vg12， Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl， 5 pm，4.6×150 mm 戴振宇1、陈静、许群1、梁立娜1、Jeffrey Rohrer²1中华人民共和国上海；?美国加利福尼亚州森尼韦尔市赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 食品分析，食品质量，Acclaim PolarAdvantage 色谱柱，Acclaim LC C18 色谱柱， Hypersil Gold Phenyl 色谱柱 目标 建立更简便、灵敏、有效的测定多种维生素矿物质复合饮料中的水溶性维生素的高效液相色谱法(HPLC)。目标分析物是B族维生素包括硫胺素(Vgr)、核黄素(Ve2)、烟酰胺(Vg3)、泛酸(Vg5)、吡哆醇(Vgs)、生物素(Vgz)、氰钴胺素(VB12)、抗坏血酸(V)。 引言 仪器 众所周知，维生素是一组化合物，对人体健康非常重要。维生素可分为两大类，水溶性和脂溶性维生素。除吡哆醇(VB6)和氰钴胺素(VB12)以外，人体无法储存水溶性维生素。因此如果膳食维生素摄入量不足，应在饮食中添加维生素补充剂。 · Thermo ScientificDionexM UItiMate3000×2双高效液相色谱系统，包括： 配置 SRD-3600 集成溶剂和脱气机机架的 DGP 3600RS 双三元快速分离泵系统 维生素补充剂可制成片剂、单种维生素强化功能饮料、维生素强化牛奶，或通过添加其他成分(如水果提取物)制成不透明的多种维生素矿物质营养饮料，使其具有更多的复合功能。为了确保这些产品中含有所标示量的维生素，许多公开的论文已经介绍了可靠的质量控制方法1。对于某种维生素片剂或功能确切的饮料，分析相对简单，常规的 HPLC 方法即能达到定量分析维生素的要求“。有些 配置 100 pL样品环和 100 pL 注射器的 WPS 3000TRS自动进样器 带2个2位-6孔切换阀的 TCC 3000RS柱温箱配置13pL流动池的 DAD-3000RS 二极管阵列检测器 ( 750 uL静态混合器 ) ·Thermo Scientific DionexM ChromeleonM 色谱数据系统 (CDS)软件7.1版。 ·Thermo Scientific Orion 2-Star 台式 pH计 样品如维生素强化牛奶和不透明多种维生素矿物质营养 饮料，除维生素外，还含有氨基酸、矿物质、辅酶Q-10，J， ·去离子水(DI)，电阻率为18.2MQ-cm 葡萄提取物等。这些添加的化合物会干扰维生素的测定。因此，我们开发出简便、灵敏的二维高效液相色谱法(2-D。乙腈(CH；CN)，高效液相色谱级， Fisher ScientificHPLC)，以实现此类样品中维生素的简便、灵敏、有效的测定。 ·磷酸二氢钾(KH，PO)(C/N P286-1)， Fisher Chemical公司 ·磷酸， 85%(H，PO)， (C/N A260-500)， Fisher Chemical 公司 ·硫胺(Vg)、核黄素(Vg2)、烟酰胺(Ve)、泛酸(Vgs)、吡哆醇(Vg6)、生物素(Vgz)、氰钴胺(Vg12)、抗坏血酸(V)，中国国家药品生物制品检定所(简称NICPBP)。 标准水溶性维生素溶液的制备方式是，分别称取 10 mg的Vg1、VB3、Vg5、VB6、Vg7、Vg12和V维生素粉，置于容量瓶，用去离子水定容至10mL，配制成每种维生素浓度均为1.0mg/mL 的储备溶液。由于VC不稳定，应即用即配制。此外，由于Vg2在水中不够稳定，Vgz储备溶液的浓度应降低到0.03 向1毫升的样品瓶中加入500pLVgz储备溶液、Vgs和Vgz储备溶液各100pL、以及Vg1、VB3、VB6、VB12和V。储备溶液各50pL。加入50pL的去离子水最后定容至1mL。在此混合标准储备液中， VBz的浓度为15pg/mL，， VBs和Vg7的浓度均为100 ug/mL， 而其他维生素的浓度为50 pg/mL。 为了制备用于校准的混合标准工作溶液，向10mL的玻璃小瓶中加入适量的混合标准储备溶液，并用去离子水定容至10mL。有关详细信息，请参阅表1。 表1.水溶性维生素的混合标准工作液的制备 混合标准工作液 1 2 3 4 5 6 用于制备10mL 的混合标准储备溶液体积(mL) 0.02 0.1 0.2 1.0 2.0 10 每种维生素的浓度(mg/L) VB2 0.03 0.15 0.3 1.5 3.0 15 Vgs， Vg7 0.2 1.0 2.0 10 20 100 0.1 0.5 1.0 5.0 10 50 由客户提供添加VB1、Vg2、Vg3、Vg5、VB6、Vg7、Vg12和VC的多种维生素矿物质营养饮料。该饮料还含有一些脂溶性 维生素、矿物质、氨基酸复合物、葡萄籽提取物、辅酶Q-10，并添加了其他成分，以满足日常营养需要。表2列出了样品组分。 表2.多种维生素营养饮料的标识值 成分 每份分量* 成分 每份分量 总碳水化合物 9g 锌(葡萄糖酸锌) 15 mg 维生素A 10000 IU 硒(L-硒蛋氨酸) 100 mcg 维生素C 1000 mg 铜(葡萄糖酸铜) 1 mg 维生素D3 200 IU 锰(葡萄糖酸锰) 5 mg 维生素E 200 IU 铬(氨基酸螯合物) 200 mcg 维生素K1 300 mcg 钾(柠檬酸) 100 mg 维生素B1 30 mg 胆碱(酒石酸) 30 mg 维生素B2 30 mg 肌醇 30 mg 维生素B3 30mg 硼(氨基酸螯合物) 1 mg 维生素B5 150 mg 氨基酸复合物(专有配方) 125 mg 维生素 B6 30 mg 葡萄籽提取物 25 mg 维生素 B7 300 mcg 辅酶0-10 5mg 维生素B12 500 mcg 二甲基甘氨酸 25 mg 叶酸 400 mcg 帕巴 30 mg 钙 600 mg 柑橘生物类黄酮 13 mg 磷 80 mg GDL 150 mg 铁(葡萄糖酸铁) 4 mg 植物中提取的矿物质 600 mg 镁(柠檬酸镁、葡萄糖酸镁) 300 mg 必要时，用去离子水稀释饮料，并用0.45 pm 滤膜过滤。将标识值与本应用说明中的校准范围比较，判断是否需要稀释样品。样品在分析之前保存在4℃条件下的棕色瓶中。 色谱条件 一维 色谱柱：除Vg12之外的水溶性维生素， Thermo ScientificAcclaim PolarAdvantage (PA1)， 5 pm， 120 A，4.6×250 mm 柱温：25℃ 流动相：A：25mM磷酸盐缓冲液(取约3.4g KH，PO溶解于1L水中，并用HPO调节PH值至3.0)B： CH，CN 梯度洗脱(见表3) 流速：0.8mL/min 进样量：10pL 紫外检测：在210nm 和 254 nm 处的吸光度 表3.梯度程序和阀切换 一维(右泵) 阀切换 二维(左泵) 时间 (min) 流速(mL/min) %A(25mM磷酸盐缓冲液，pH3.0) %B(CH，CN) 时间(min) 右阀位 左阀位 时间(min) 流速(mL/min) %A(25mM酸盐缓冲液，pH3.0) %B (CH，CN) 0 0.8 100 0 0 6-1 1-2 0 0.8 100 14 0.8 100 0 3.94 1-2 6-1 5 0.8 100 0 23.5 0.8 50 50 4.3 6-1 1-2 12.5 0.8 65.0 35.0 24 0.8 0 0 5.32 1-2 6-1 13.0 0.8 20.0 80.0 30 0.8 0 0 5.89 6-1 1-2 21.0 0.8 20.0 80.0 - - 7.8 1-2 1-2 21.5 0.8 100 0 - 一 - 8.35 6-1 6-1 30 0.8 100 0 — 13.12 1-2 1-2 一 - 13.28 6-1 6-1 - - 14.61 1-2 1-2 - - - - 14.82 6-1 6-1 一 15.42 1-2 1-2 一 15.60 6-1 6-1 一 - 15.97 1-2 1-2 - 一 - - 16.12 6-1 6-1 - - 28.5 6-1 1-2 *食用份量：1fl.Oz. 二维 色谱柱： Acclaim C18，5um， 120A， 4.6×150mm 柱温：25℃ 流动相：与第一维中使用的相同 流速：0.8mL/min 紫外检测：在210nm、245nm、268nm 和291 nm 处的吸光度 测定维生素的传统高效液相色谱法 目前， 《美国药典》中尚没有关于八种水溶性维生素混合物的分离方法。 《美国药典》中对个别维生素的测定 方法较为复杂(例如，测定生物素需要用到高氯酸钠、磷酸、二甲亚砜、乙腈和水)，并要利用离子对试剂，以保留亲水性维生素。由于离子对试剂对色谱柱性能会产生不可逆转的影响，故研究人员作了大量研究，旨在找到不使用离子对试剂而采用更为简单流动相的方法。最近，据报导有研究者采用酸性或中性磷酸盐缓冲液/有机溶剂流动相，分离多种维生素片提取物和维生素强化功能性饮料中的维生素，但前述两种产品没有本文研究的饮料复杂。对于某些多种维生素营养饮料等复杂的样品，其中添加物会干扰维生素的分离并最终干扰到紫外光谱对维生素的测定。图1中的色谱图显示多种维生素营养饮料采用常规 HPLC测定，由于出现大量紫外吸收干 图1.采用传统的高效液相色谱法(HPLC)，标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图 2-D-HPLC的说明 2-D-HPLC 法已被用于实现复杂样品的高效分离。采用不同的双色谱柱不但能提供更强大的分离能力，而且采用在线2-D-HPLC 中的 Heart-Cut 能够简化第二维的分离。图2显示了用于本应用说明中二维高效液相色谱仪的配置。经过简单的样品制备(必要时，过滤样品后，用去离子水稀释)，进样后在第一维使用 Acclaim PA 1 色谱柱进行部分分离。紫外检测器可在线监测目标物在何处洗脱。通 过进样混合标准工作溶液，测定每种维生素出峰开始和结束时间。根据这些值切换阀。右边阀切换到1-2位时，可将维生素色谱峰单独输送到第二维流路。对于早期洗脱维生素峰，左边的阀切换到1-6位，使这些维生素组分直接转移到第二个色谱柱。对于后期洗脱维生素光谱峰，左阀切换到1-2位，使 750pL 混合器在线。在此配置中，第二维中的水流动相可稀释第一维流动相中的乙腈，以此确保维生素在第一维色谱柱得到保留。 图2.二维高效液相色谱系统的配置 当右阀切换到1-2位时，紫外检测器1将把两个色谱柱连接起来。第二维色谱柱的背压会超过紫外检测器1流动池的压力极限。因此，选择适当的颗粒大小和第二色谱 柱长度，以确保背压低于流动池的压力极限。也可以在仪器方法中设置压力极限指令，以便当背压过高时可随时停止流动。 图3.具有不同配置的标准混合物的二维色谱图 使用 Hypersil Gold Phenyl 色谱柱作为第一维柱时，可满足这—一需求。如图4所示，采用PA 色谱柱作为第一维时，在色谱图上的245 nm 处无法检测到VB12。当采用 Hypersil GoldPhenyl 色谱柱作为第一维时，可检测到V812(图5)。 图4.在第一维度使用 Acclaim PA 1 分析柱条件下，标准昆合物与多维营养饮料样品的色谱图 图5.在第一维度使用 Hypersil Gold Phenyl 分析柱，VB12标准品和b)多维营养饮料样品的色谱图 连续8次进样水溶性维生素，估算保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表4示。图6则显示了8次进样的叠加色谱图。 通过三次连续进样不同浓度的混合标准溶液，采用外标法得到线性工作校准曲线，用于定量样品中的水溶性维生素，结果见表5。采用置信度为99%时的single-sidedStudent's test 方法，估算方法检测限(MDL)，结果见表5。 图6.连续八次注射标准水溶性维生素混合物色谱图的叠加 表4.水溶性维生素的保留时间和峰面积的重现性 水溶性维生素 保留时间相对标准偏差 峰面积相对标准偏差 Vg 0.05 1.08 VB2 0.02 0.32 VB3 0.11 0.62 VB5 0.03 0.36 VB6 0.03 0.45 VB7 0.02 0.87 VB12 0.02 0.48 Vc 0.1 3.44 表5.校准数据和水溶性维生素的方法检出限(MDL) 水溶性维生素 检测波长(nm) 范围 (pg/mL) 回归方程 r 相对标准偏差 方法检测限(ug/mL) V1 245 0.5-10 A=0.1755c-0.1080 0.9978 5.5700 0.30 VB3 268 0.5-50 A=0.2385c+0.0276 0.9999 0.6985 0.23 VB6 291 0.5-50 A=0.2918c+0.1237 0.9999 0.6012 0.18 VB5 210 1.0-100 A=0.0462c+0.0161 0.9999 1.5145 0.26 VB12 245 0.5-50 A=0.1026c+0.0153 0.9999 1.3333 0.20 VB2 268 0.1-15 A=0.9618c-0.0423 0.9995 3.5503 0.03 V7 210 2-100 A=0.0101c 0.9994 3.1306 1.5 Vc 245 / / / / / 样品分析 可能由于在样品中的浓度较低，在多种维生素的营养饮料中未检测到Vg7和Ve12， Ve3亦未检出。当按标识值Ve3到样品中时，其回收率达到96%。因此，本方法能够测定 V3。检测到其水水溶性维生素接近其标识值。虽然VC在标准工作溶液中不稳定，但在多种维生素营养饮料中相对稳定。正如图7中所示，V是样品色谱图中的主要峰。 样品测定结果见表6。 图7.多维营养饮料样品(稀释100倍)的第二维色谱图 表6.多种维生素营养饮料样品中水溶性维生素的分析结果 被分析物 标示 mg/mL* 检定 pg/mL 加入 pg/mL 发现 ug/mL 回收率% V 1 1.03 1 1.98 95 VB3 1 不适用 1 0.96 96 VB6 1 1.1 1 2.2 110 VB5 5 4.51 2 6.03 76 V812 0.015 不适用 1 0.83 83 VB2 1 1.03 0.3 1.34 103 VB7 0.01 不适用 2 2.30 115 Ve 35 检测到 / / / *在分析前取样品稀释1000倍；从而1 mg/mL 应被检测为1ug/mL。 本研究描述了一种能够简化复杂样品如多种维生素营养饮料中维生素含量测定的二维高效液相色谱法。方法由l变色龙软件控制的 UltiMate 3000 HPLC 双泵系统进行测定，简单，快速和有效。 ( 1. 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